利用PlantCyc数据库通过计算方法筛选DNMT1抑制剂，进而评估天然化合物在乳腺癌中的抗癌潜力

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：In Silico Identification of DNMT1 Inhibitors from the PlantCyc Database through Computational Approach to Assess the Anti-Cancer Potential of Nutraceutical Compounds in Breast Cancer

　　里蒂卡·帕拉沙尔|潘卡吉·塔内贾
印度大诺伊达莎尔达大学莎尔达生物科学与技术学院生物技术系

摘要：乳腺癌在全球癌症相关死亡中占比极高，仅2022年就有67万人死于该病，同时有230万新发病例。现有的治疗方法具有较大的毒性，且对现有药物的耐药性问题仍是尚未解决的临床难题。DNA甲基转移酶1（DNMT1）在DNA复制过程中起着维持全基因组甲基化模式的关键作用，由于其功能失调会导致肿瘤抑制基因通过启动子过度甲基化而沉默，因此被视为乳腺癌治疗的重要靶点。本研究采用分层计算机模拟方法，从PlantCyc数据库（v16.0.3）中筛选出4,549种植物源化合物，针对人类DNMT1催化结构域（PDB ID: 4WXX）进行检测。其中得分最高的10种化合物进一步通过AutoDock Vina进行分子对接实验，结果发现槲皮素和山柰酚的结合亲和力最高，分别为?9.5 kcal/mol，而吴戈宁和黄樟素的结合亲和力也相当高，分别为?9.3 kcal/mol和?8.1 kcal/mol。通过ADMET-AI进行的药代动力学评估表明，这10种化合物均符合利平斯基五规则，且在人体肠道中的吸收率在0.98以上。鉴于吴戈宁和黄樟素具备良好的ADMET特性，且目前关于它们与乳腺癌中DNMT1相互作用的资料较少，因此选择这两种化合物使用GROMACS软件进行100纳秒的全原子分子动力学模拟。在所有评估指标中，包括主链RMSD、残基波动、回转半径、溶剂可及表面积以及分子间氢键数量，吴戈宁形成的复合物更为稳定且结构紧凑。这些研究结果表明，吴戈宁和黄樟素是具有非毒性的营养保健品候选物质，有望用于针对DNMT1的表观遗传疗法，其计算结果为后续的体外和体内验证研究提供了有力依据。

引言：乳腺癌是全球女性中最常见的癌症类型。2022年，该病导致近67万人死亡，同时还新增230万女性患者[1]。人们普遍存在一种错误观念，认为乳腺癌只是女性才会患上的疾病，但实际上男性也会患上此病，约占所有病例的0.5-1%[1]。多种风险因素会增加患病几率，包括年龄增长、肥胖、家族病史、既往辐射暴露、饮酒以及吸烟等。病因的多样性反映了该疾病的生物学复杂性，使得难以找到普适有效的治疗策略。目前的标准治疗方案包括化疗、激素疗法、靶向生物制剂、放疗以及手术切除。然而，这些治疗方法都存在严重的副作用，化疗药物会导致呕吐、脱发、心脏损伤、血栓形成、神经损伤以及非目标细胞的DNA损伤[2]；放疗虽能有效降低局部复发率，但也会损害周围的正常组织。无论是先天性的还是后天获得的药物耐药性，都是阻碍这些疗法长期发挥作用的障碍，尤其是在三阴性乳腺癌中，这类癌症不存在像激素疗法和HER2靶向疗法那样的可靶向表面受体。在这种背景下，植物源生物活性物质作为潜在的癌症治疗手段越来越受到重视。营养保健品是一类源自食物的化合物，它们可通过多种机制抑制与癌症相关的信号通路，如NF-κB、p38 MAPK和Nrf2通路，还能诱导细胞凋亡、抑制肿瘤转移并阻止细胞周期进展[3][4]。纽曼和克拉格[5]通过对1940年至2019年间获批的抗癌药物进行分析，证明了天然产物作为药物来源的重要性，因为大多数抗癌药物都来源于天然或天然衍生的物质。植物代谢物具有结构多样性、相对较低的毒性，且能够作用于多个致癌节点，因此非常适合用于针对特定表观遗传机制的计算机筛选研究。

DNMT1在乳腺癌的表观遗传学研究中处于核心地位。作为主要的维持性甲基转移酶，它在每一轮DNA复制过程中都会将甲基从S-腺苷-L-甲硫氨酸转移到半甲基化的CpG位点上，从而将甲基化模式从母链传递到子链上。在乳腺肿瘤细胞中，DNMT1的异常过表达或功能失调会导致肿瘤抑制基因启动子过度甲基化，从而使那些原本能够抑制细胞增殖、侵袭和存活的基因失去功能[6]。在乳腺癌模型中，DNMT1-PAS1-PH20调控轴直接控制着肿瘤的生长和转移[7]，而DNMT1介导的MEG3长非编码RNA启动子过度甲基化则会抑制这种生长抑制剂的作用，进而促进肿瘤发展[8]。在三阴性乳腺癌中，由于不存在可靶向的受体，通过虚拟筛选和分子动力学模拟方法，已经证实抑制DNMT1是一种合理的策略[9]。在HER2阳性乳腺癌中，DNMT1抑制剂DI-1能够降低PTEN启动子的甲基化水平，同时提高细胞对HER2靶向药物的敏感性，这说明将表观遗传学策略与致癌基因靶向策略相结合具有协同效应[10]。目前已获批的DNMT抑制剂阿扎胞苷和地西他滨属于核苷类似物，它们通过共价结合的方式将DNMT1固定在半甲基化位点上。不过，这些药物的临床应用存在诸多缺陷，包括在生理pH值条件下化学稳定性差、剂量限制性的骨髓抑制作用，以及可能被整合到肿瘤细胞和正常细胞的DNA中的风险。而天然来源的非核苷类抑制剂则具有不同的作用机制，因此不存在上述问题。PlantCyc数据库（v16.0.3）是植物代谢网络（PMN）的一部分，其中包含了4,549种经过验证的植物次生代谢物，包括黄酮类、萜类、生物碱和酚类等，这些数据都有数百种植物物种的实验验证作为支撑[11]。在投入大量实验资源之前，先利用计算机对该数据库中的化合物进行筛选，是一种成本高效的候选物质筛选方法。本研究建立了四阶段的计算机分析流程，首先对4,549种PlantCyc化合物进行高通量虚拟筛选，然后进行分子对接，接着进行ADMET参数分析，最后对表现最优异的两种化合物进行100纳秒的分子动力学模拟。研究的目的是寻找具有DNMT1抑制作用且药代动力学特性适合药物开发的营养保健品候选物质，最终期望找到能够逆转启动子过度甲基化、恢复乳腺癌中肿瘤抑制基因表达的药物。

吴戈宁（5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮；CAS 632-85-9；分子量284.27 Da）是一种天然存在的O-甲基化黄酮，从黄芩中分离得到。其分子结构在5位和7位上含有羟基，在8位上含有甲氧基，这些结构特征使其比槲皮素等高度羟基化的黄酮类物质具有更高的脂溶性和膜通透性。其良好的物理化学性质（LogP值为2.87，PAMPA通透率为0.91）有助于其在细胞内的有效摄取。在药理作用方面，吴戈宁在多种癌症模型中表现出抗炎、抗增殖以及促细胞凋亡的作用。先前的研究显示，它能够抑制结肠癌细胞中DNMT1的表达，并促进p16肿瘤抑制基因启动子的去甲基化[21]。此外，它还能在乳腺癌细胞中诱导G1/S期细胞周期停滞以及线粒体介导的细胞凋亡。由于其较高的药物相似度（QED值为0.756）和较低的预期毒性，吴戈宁被认为是一种极具潜力的DNMT1靶向抗癌候选物质。黄樟素（CAS 6754-58-1；分子量354.40 Da）是从啤酒花中提取的主要预烯基化查尔酮类化合物。它的分子结构包含一个α,β-不饱和羰基结构，同时还有预烯基和甲氧基取代基，这些结构特征提升了它的疏水性和膜通透性（LogP值为4.21，PAMPA通透率为0.84）。在所有分析过的化合物中，黄樟素的P-糖蛋白抑制评分也是最高的，这一特性可能有助于克服乳腺癌中的药物耐药性。在生物学功能方面，黄樟素通过抑制NF-κB信号通路、诱导G1期细胞周期停滞以及调节雌激素受体信号通路，展现出显著的抗癌活性[22]。它的抗血管生成特性以及良好的物理化学性质，进一步证明了其作为DNMT1靶向抗癌药物的潜力。

植物Cyc数据库中的化合物库：该植物化学化合物数据集来自PlantCyc v16.0.3，该数据库是植物代谢网络（PMN）的组成部分[11]，其中存储了来自多种植物物种的经过实验验证以及计算机推断的代谢数据。这4,549种化合物的数据库以结构数据文件（SDF）格式存在。所有化合物结构都在Open Babel软件中进行处理，利用MMFF94力场生成能量最低的三维构象，之后再将文件转换为PDBQT格式，以便用于后续的分子对接分析。

目标蛋白的获取与准备：高分辨率晶体结构……

讨论：为了从4,549种化合物组成的PlantCyc数据库中筛选出具有DNMT1抑制作用的营养保健品，本研究采用了涵盖虚拟筛选、分子对接、ADMET参数分析以及分子动力学模拟的多步骤计算机模拟方法。选择吴戈宁和黄樟素进行分子动力学模拟，是因为在综合考虑分子对接亲和力以及药代动力学方面的可行性和安全性之后做出的决策，这一选择也弥补了目前关于计算机辅助识别DNMT1抑制剂的文献研究不足。

结论：本研究通过结合虚拟筛选、分子对接、ADMET参数分析以及100纳秒分子动力学模拟的四阶段计算机模拟流程，对PlantCyc数据库中的4,549种植物化学化合物进行了筛选，以检测它们与人类DNMT1的相互作用。槲皮素和山柰酚的分子对接亲和力最高，为?9.5 kcal/mol，但鉴于吴戈宁和黄樟素在结合能、药物相似度、安全性以及动态稳定性等方面都具有较为均衡的表现，因此被认定为最具开发潜力的候选物质。

作者贡献声明：潘卡吉·塔内贾：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化分析，验证工作，项目监督，软件使用，资源协调，项目管理，方法设计，实验研究，正式分析，数据整理，概念构思。里蒂卡·帕拉沙尔：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，可视化分析，验证工作，软件使用，资源协调，项目管理，方法设计，实验研究，正式分析，数据整理，概念构思。

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

数据可用性：数据可在提出请求后提供。

生成式人工智能及人工智能辅助技术声明：作者仅使用AI辅助工具ChatGPT来优化手稿的标点、语法和可读性，对于手稿的内容，作者承担全部责任。

利益冲突声明：? 作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢：无。