《Journal of Structural Geology》：miR-10a-5p Attenuates Spinal Cord Ischemia/Reperfusion Injury by Targeting Transforming Growth Factor Beta-Activated Kinase 1 to Suppress Acyl-CoA Synthetase Long-Chain Family Member 4-Mediated Ferroptosis in Male Rats
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背景 脊髓缺血/再灌注(I/R)损伤是胸腹主动脉手术后的一种严重并发症，常导致截瘫。铁死亡(Ferroptosis)，一种铁依赖性调节性细胞死亡形式，对这种病理生理过程有显著贡献。本研究旨在探讨miR-10a-5p是否通过靶向转化生长因子β激活激酶1(TAK1
背景 脊髓缺血/再灌注(I/R)损伤是胸腹主动脉手术后的一种严重并发症，常导致截瘫。铁死亡(Ferroptosis)，一种铁依赖性调节性细胞死亡形式，对这种病理生理过程有显著贡献。本研究旨在探讨miR-10a-5p是否通过靶向转化生长因子β激活激酶1(TAK1)来减轻脊髓I/R损伤，从而抑制酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)介导的铁死亡和神经炎症。
方法 研究人员通过瞬时主动脉闭塞在雄性Sprague-Dawley大鼠中建立了脊髓I/R损伤模型。在诱导缺血前，研究人员鞘内注射了铁死亡抑制剂Liproxstatin-1(Lip-1)、靶向ACSL4或TAK1的siRNA以及miR-10a-5p agomir/antagomir。通过Tarlov评分评估神经功能。组织病理学变化通过H&E、Nissl和免疫荧光染色进行评估。线粒体超微结构通过透射电子显微镜(TEM)检查。铁死亡相关标志物（ACSL4、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、环氧合酶2(COX2)、铁蛋白重链1(FTH1)）、炎性细胞因子（肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)）和脂质过氧化产物（丙二醛(MDA)、12-羟基二十碳四烯酸(12-HETE)、15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)、脂质过氧化物(LPO)）的表达水平采用Western blot、定量聚合酶链式反应(qPCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测量。miR-10a-5p与TAK1之间的靶向关系通过双荧光素酶报告基因分析进行验证。
结果 脊髓I/R损伤诱导了显著的神经功能障碍、铁死亡（表现为铁、丙二醛(MDA)、ACSL4和COX2增加；GPX4和谷胱甘肽(GSH)减少）、脂质过氧化和炎症。Liproxstatin-1(Lip-1)治疗改善了这些变化。ACSL4或TAK1的敲低同样抑制了铁死亡，减轻了炎症，并改善了运动功能。脊髓I/R损伤导致miR-10a-5p显著下调。荧光素酶分析证实，miR-10a-5p直接靶向TAK1。因此，miR-10a-5p过表达抑制了TAK1/ACSL4轴，减轻了脂质过氧化和铁死亡，并降低了促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)）的水平，从而改善了神经功能结果。
结论 本研究表明，miR-10a-5p通过靶向TAK1在脊髓I/R损伤中发挥保护作用，从而抑制ACSL4介导的铁死亡和神经炎症。这些发现突出了miR-10a-5p/TAK1/ACSL4轴作为预防和治疗脊髓I/R损伤的新型治疗靶点的潜力。
**论文解读**
**研究背景及问题**
脊髓缺血/再灌注(I/R)损伤是胸腹主动脉瘤手术和脊柱外科手术后常见的严重并发症，可导致严重的神经功能障碍，甚至截瘫，严重影响患者的生存预后和生活质量。尽管外科技术不断进步，但脊髓I/R损伤的发生率仍然居高不下，且目前尚缺乏有效的预防和治疗策略。其发病机制高度复杂，涉及多种细胞损伤和死亡途径。因此，深入阐明脊髓I/R损伤的潜在分子机制，对于开发新型干预措施至关重要。
近年来，铁死亡(Ferroptosis)作为一种新发现的、铁离子依赖性的调节性细胞死亡形式，被证实与多种中枢神经系统疾病密切相关，如帕金森病、中风、胶质瘤和肌萎缩侧索硬化症。研究人员团队先前的研究也表明，铁死亡在脊髓I/R损伤中扮演重要角色。例如，EphA4通过促进Beclin1-XCT复合物的形成并激活Erk1/2/c-Myc/转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1)轴来调节脊髓前角运动神经元的铁死亡。而Synoviolin 1 (SYVN1)则通过HMGB1/NRF2/HO-1轴来预防脊髓I/R损伤中的铁死亡。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4 (ACSL4)被认为是铁死亡的敏感调节因子和重要贡献者，在脑、肺、肾、心肌和肠道I/R损伤中均被证实介导铁死亡。
转化生长因子-β(TGF-β)激活激酶1 (TAK1)是丝裂原活化蛋白激酶激酶(MAP3K)家族的一员，是JNK/p38的上游蛋白。TAK1在肝脏、心肌和肾脏I/R损伤中发挥着重要作用。研究表明，肝细胞中TAK1的缺失可诱导氧化应激介导的铁死亡，提示TAK1可能与铁死亡调节有关。然而，TAK1/ACSL4通路是否参与脊髓I/R损伤尚待研究。
微小RNA (miRNAs)是一类高度保守的非编码RNA，通过与靶mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)结合，抑制mRNA翻译并负向调节蛋白质表达。研究人员团队先前的研究已表明miRNAs参与脊髓I/R损伤。miR-10a-5p在神经系统疾病中发挥作用，例如它能抑制脑源性神经营养因子(BDNF)的翻译，且其长期表达受青春期乙醇暴露影响。值得注意的是，miR-10a-5p过表达已被证明能抑制白细胞介素-6受体(IL-6R)表达并部分消除IL-6诱导的铁死亡。此外，多项研究提示miRNAs可直接靶向TAK1，但miR-10a-5p在脊髓I/R损伤中调节TAK1的作用尚无报道。
**研究目的**
鉴于上述背景，本研究旨在通过建立大鼠脊髓I/R损伤模型，探究TAK1/ACSL4介导的铁死亡是否在脊髓I/R损伤中发生，以及miR-10a-5p是否通过调节TAK1来控制ACSL4介导的铁死亡。该论文发表在《Journal of Structural Geology》。
**主要关键技术方法**
为了开展这项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：
1. **脊髓I/R损伤模型构建与干预：** 在雄性Sprague-Dawley大鼠（N=102）中，通过瞬时主动脉闭塞法建立了脊髓I/R损伤模型。随后，通过鞘内注射的方式，研究人员给予大鼠铁死亡抑制剂Liproxstatin-1 (Lip-1)、靶向ACSL4或TAK1的siRNA (小干扰RNA)、以及miR-10a-5p agomir (模拟物)或antagomir (抑制剂)，以干预和观察相关通路的变化。
2. **神经功能与组织病理学评估：** 采用Tarlov评分系统对大鼠的后肢运动功能进行定量评估。通过苏木精-伊红(H&E)染色和尼氏(Nissl)染色评估脊髓组织的病理变化和神经元损伤程度。此外，免疫荧光染色用于检测特定蛋白的表达及其在不同细胞类型中的定位。
3. **细胞超微结构观察：** 利用透射电子显微镜(TEM)对脊髓组织中的线粒体超微结构进行高分辨率观察，以识别铁死亡特有的线粒体形态学改变，如膜密度增加、嵴紊乱或基质浓缩。
4. **分子生物学与生化分析：** 采用Western blot技术检测关键铁死亡相关蛋白（如ACSL4、GPX4、COX2、FTH1）、炎症相关蛋白（如TAK1）的表达水平。通过实时定量聚合酶链式反应(qPCR)检测ACSL4、TAK1的mRNA以及miR-10a-5p的表达水平。酶联免疫吸附测定(ELISA)用于量化炎性细胞因子（肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)）和脂质过氧化产物（如12-HETE、15-HETE、LPO）。此外，Ferene S比色法、GPX4活性试剂盒、DTNB比色法、硫代巴比妥酸(TBA)反应和FOX-2方法分别用于检测组织中的铁含量、GPX4活性、还原型谷胱甘肽(GSH)水平、丙二醛(MDA)含量和脂质过氧化水平。
5. **miRNA靶向验证：** 采用生物信息学工具预测miR-10a-5p与TAK1的靶向关系，并通过双荧光素酶报告基因分析(dual-luciferase reporter assay)在细胞水平上实验性验证miR-10a-5p对TAK1的直接调控作用。
**研究结果**
**脊髓I/R损伤后神经运动功能和铁死亡相关标志物的时间动态变化**
通过Tarlov评分和脊髓组织生化指标（铁、MDA、GPX4、GSH、12-HETE、15-HETE、LPO）的测量，研究人员发现脊髓I/R损伤大鼠的神经运动功能在损伤后24小时达到最严重的缺陷，并持续存在。同时，脊髓组织中的铁、丙二醛(MDA)、12-羟基二十碳四烯酸(12-HETE)、15-羟基二十碳四烯酸(15-HETE)和脂质过氧化物(LPO)水平呈时间依赖性显著升高，而谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)活性和还原型谷胱甘肽(GSH)浓度则显著降低。这些结果表明脊髓I/R损伤可诱导显著的神经功能障碍，并伴随铁的积累、脂质过氧化和谷胱甘肽系统的耗竭，提示铁死亡在损伤发生后发挥关键作用。
**铁死亡抑制剂Lip-1改善脊髓I/R损伤后的神经运动功能，抑制铁死亡和脂质过氧化**
通过Tarlov评分、透射电子显微镜(TEM)对线粒体超微结构的观察、H&E染色评估神经元形态以及Western blot分析铁死亡相关蛋白（ACSL4、COX2、GPX4）的表达，研究人员发现，铁死亡抑制剂Liproxstatin-1(Lip-1)治疗显著改善了I/R诱导的神经功能障碍。Lip-1减轻了线粒体损伤，恢复了神经元完整性，并逆转了ACSL4和环氧合酶2(COX2)表达升高以及GPX4表达降低的趋势。此外，Lip-1还显著抑制了脂质过氧化产物12-HETE、15-HETE和LPO的积累。这些发现进一步证实铁死亡在脊髓I/R损伤中是关键的病理机制，且抑制铁死亡具有神经保护作用。
**ACSL4敲低抑制铁死亡，减轻炎症反应，改善脊髓I/R损伤后的神经运动功能**
通过Western blot分析ACSL4蛋白的时间动态变化，研究人员发现ACSL4在脊髓I/R损伤后24小时达到表达高峰。免疫荧光共染显示ACSL4主要表达于NeuN?神经元，而非Iba1?小胶质细胞或GFAP?星形胶质细胞，表明ACSL4在损伤后主要在神经元中被诱导。鞘内注射si-ACSL4 (靶向ACSL4的siRNA)显著改善了I/R损伤后的运动功能恢复。qPCR和Western blot证实了si-ACSL4有效地抑制了ACSL4的mRNA和蛋白表达。ACSL4沉默逆转了I/R诱导的铁死亡相关蛋白（如COX2升高、GPX4和铁蛋白重链1(FTH1)降低）的失调，并通过TEM观察显示保存了线粒体完整性并显著减少了铁死亡样线粒体的数量。尼氏染色也表明ACSL4敲低减轻了前角神经元损伤。这些结果明确指出ACSL4介导的铁死亡在脊髓I/R损伤中发挥关键作用，且其敲低可有效减轻损伤。
**TAK1敲低改善脊髓I/R损伤后的神经运动缺陷并抑制铁死亡**
通过Tarlov评分、H&E染色和尼氏染色评估神经功能和组织病理学变化，研究人员发现鞘内注射si-TAK1 (靶向TAK1的siRNA)显著改善了神经功能恢复，保存了运动神经元存活，并逆转了尼氏小体(Nissl bodies)的分散。Western blot和qPCR证实TAK1敲低有效抑制了I/R诱导的TAK1表达升高。免疫荧光和Western blot分析进一步显示，TAK1敲低抑制了ACSL4的过表达，并逆转了COX2升高和GPX4降低的趋势，从而减轻了脂质过氧化。同时，促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)的水平也显著降低。这些结果表明TAK1在脊髓I/R损伤中同时调控铁死亡和神经炎症，且其抑制具有多重保护作用。
**miR-10a-5p过表达通过靶向TAK1抑制脊髓I/R损伤中的铁死亡**
通过实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析，研究人员发现脊髓I/R损伤可导致miR-10a-5p显著下调，在损伤后24小时下降最为明显。生物信息学分析工具TargetScan预测到miR-10a-5p与TAK1 mRNA的3′UTR存在保守结合位点，并通过双荧光素酶报告基因分析证实了这种直接的靶向关系。鞘内递送miR-10a-5p模拟物有效恢复了其在I/R损伤脊髓中的表达，并显著抑制了I/R诱导的TAK1在mRNA和蛋白水平上的上调，而miR-10a-5p抑制剂则产生相反效果。功能上，miR-10a-5p过表达显著改善了运动功能（Tarlov评分），并通过Western blot和qPCR分析显示，逆转了ACSL4升高和GPX4降低的铁死亡标志物变化。此外，ELISA结果显示，miR-10a-5p模拟物还抑制了I/R诱导的促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的升高。这些结果揭示了miR-10a-5p通过靶向TAK1/ACSL4轴发挥神经保护作用，抑制铁死亡和神经炎症。
**讨论与结论**
本研究的发现确证了铁死亡是脊髓缺血/再灌注(I/R)损伤中的一个关键病理机制。研究人员揭示了一个新颖的调控轴，即miR-10a-5p通过直接靶向转化生长因子β激活激酶1(TAK1)来抑制酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)介导的铁死亡及其继发的神经炎症。
研究人员进一步确认了铁死亡是由芬顿反应(Fenton reaction)触发的铁依赖性调节性细胞死亡形式，其中细胞内游离铁催化生物膜上多不饱和脂肪酸(PUFAs)的过氧化。Liproxstatin-1(Lip-1)作为一种特异性脂质过氧化抑制剂，在心脏、肾脏和肺部的I/R模型中均显示出保护作用。本研究的数据也一致表明，Lip-1治疗能减少脊髓中的铁积累、脂质过氧化和炎症细胞因子释放。
酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)被确定为铁死亡的关键执行者，它通过催化长链多不饱和脂肪酸（如花生四烯酸(AA)和肾上腺酸）酯化为其CoA衍生物，从而促进膜脂质过氧化。越来越多的证据表明ACSL4是各种I/R损伤中铁死亡的关键介质。本研究中，通过鞘内注射siRNA敲低ACSL4显著改善了脊髓I/R损伤后的运动功能恢复，并通过恢复还原型谷胱甘肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)水平、减少铁积累和保存线粒体完整性来提供神经保护。同时，促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)）和TAK1的表达也随ACSL4沉默而降低。
转化生长因子-β激活激酶1(TAK1)作为MAP3K家族成员，在中枢神经系统神经元中主要表达，并调控炎症、细胞凋亡和细胞焦亡等多种通路。研究发现，TAK1敲低不仅抑制了神经炎症（减少TNF-α和IL-1β），还下调了ACSL4的表达。这表明在脊髓I/R损伤期间，TAK1在铁死亡通路中作用于ACSL4的上游。沉默TAK1有效抑制了神经元铁死亡并改善了运动功能结局，突显了其在炎症和铁依赖性细胞死亡中的双重调节作用。
微小RNA(miRNAs)是中枢神经系统中的关键转录后调节因子，其失调对脊髓损伤后的神经再生有显著影响。本研究发现脊髓I/R损伤后miR-10a-5p显著下调。通过生物信息学预测和双荧光素酶报告基因分析，研究人员证实TAK1是miR-10a-5p的直接靶点。机制上，miR-10a-5p的过表达抑制了TAK1的翻译，进而导致ACSL4的下调。这一级联反应导致铁死亡的抑制、神经炎症的减轻，并最终显著改善了运动功能。这些发现揭示了miR-10a-5p/TAK1/ACSL4轴在缺血脊髓中调控铁死亡性细胞死亡的新作用。
研究人员也指出本研究存在局限性，即仅使用了雄性大鼠以避免动情周期相关的生理变异性，因此未来研究应纳入雌性受试者以系统评估潜在的性别相关差异。
本研究结果阐明了一个保护性通路，即miR-10a-5p通过靶向转化生长因子β激活激酶1(TAK1)减轻脊髓缺血/再灌注(I/R)损伤，进而抑制酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)介导的铁死亡及相关的炎症级联反应。这些发现突出了靶向miR-10a-5p/TAK1/ACSL4通路在预防和治疗脊髓缺血/再灌注损伤方面的治疗潜力。
