缺氧激活型PROTAC双靶点抑制FAK与EGFR实现协同机械-化学肿瘤治疗

《Neoplasia》：Hypoxia-activated PROTAC for dual inhibition of FAK and EGFR enables synergistic mechano-chemical cancer therapy

　　

肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME)中的机械异常，如基质硬化和缺氧，驱动肿瘤侵袭和治疗抵抗。然而，以空间精度靶向这些信号仍具挑战性。本研究提出一种缺氧响应型双弹头PROTAC (hr shiny head PROTAC-hrFP-E)，其将黏着斑激酶 (Focal Adhesion Kinase, FAK) 降解与表皮生长因子受体 (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 抑制相偶联，引入了一种机械-化学治疗范式。hrFP-E配备硝基还原酶 (Nitroreductase, NTR) 敏感基序，在缺氧区域被激活后释放FAK降解剂 (FP) 和EGFR抑制剂 (Erlotinib)。在肺癌模型中，hrFP-E诱导近乎完全的FAK耗竭 (约96-99%) 和显著的EGFR通路抑制 (约88%)，在二维和三维实验中均产生协同抗迁移和抗增殖效应。机制上，FAK降解稳定大型黏着斑，改变肌动蛋白-肌球蛋白收缩力，升高活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS)，并减少胶原沉积，共同重编程TME。体内实验中，hrFP-E实现约66%的肿瘤生长抑制且无显著毒性，同时降低组织硬度和胶原密度。该平台具有固有模块性，可兼容其他致癌驱动因子和疾病特异性开关。本研究建立了机械-化学治疗学的概念，即时空可控的降解剂在重布线肿瘤力学的同时调控生长信号，为实体瘤治疗提供了可推广的策略。

靶向单一致癌通路的癌症治疗虽已取得显著成功，但常因肿瘤信号网络的适应性可塑性而产生治疗抵抗。特别是表皮生长因子受体 (EGFR) 抑制剂在EGFR突变型癌症如非小细胞肺癌中可延长生存期，但几乎所有患者最终均因肿瘤绕过被阻断通路而复发。其中一种主要代偿机制是通过黏着斑激酶 (FAK) 激活细胞黏附介导的信号传导。FAK是一种非受体酪氨酸激酶，协调机械转导，在侵袭性肿瘤中频繁过表达且与不良预后相关。其激活驱动肿瘤细胞存活、侵袭、转移甚至治疗抵抗，既通过其激酶活性也通过支架蛋白相互作用实现。值得注意的是，FAK信号 (如通过整合素αVβ3) 已被证明可赋予EGFR突变型癌症对EGFR酪氨酸激酶抑制剂的抵抗。这些发现强调同时靶向生长信号 (EGFR) 和机械转导通路 (FAK) 可产生协同抗肿瘤效应并防止通路串扰导致的抵抗。

联合疗法共同抑制多个靶点在概念上具有吸引力， indeed在临床前和临床研究中已显示出改善的疗效。例如，MAPK通路与FAK的双重阻断在早期试验中取得了显著反应。然而，同时靶向两种信号激酶可能加剧正常细胞的全身毒性。理想解决方案是在肿瘤组织中选择性激活治疗的同时保护正常细胞。缺氧作为实体瘤的标志，为此类选择性提供了有价值的触发因素。由于异常血管形成和高氧耗，缺氧创造了促进侵袭和治疗失败的恶劣TME。数十年来，大量研究致力于利用缺氧激活仅在低氧区域释放细胞毒素的前药。某些缺氧激活前药 (如硝基咪唑衍生物evofosfamide) 在临床前模型中显示出前景，但未能显著改善患者生存。对于激酶抑制剂如FAK抑制剂，一个主要原因是忽视了激酶蛋白的支架功能。这些失败凸显了需要更彻底的缺氧TME靶向治疗抑制策略。

蛋白水解靶向嵌合体 (Proteolysis-Targeting Chimeras, PROTACs) 已成为利用泛素-蛋白酶体系统实现靶向蛋白降解的革命性方法。与传统抑制剂仅阻断活性位点不同，PROTACs消除整个靶蛋白，从而消融所有酶促和支架功能。PROTAC介导的FAK降解正在癌症治疗中积极探索，该方法可克服某些耐药机制 (如突变扩增信号或非酶促致癌功能)，并在某些情况下表现出更高的选择性。硝基还原酶 (NTR) 是一种在缺氧区域高度富集但在正常组织中表达极少的酶，已被用于选择性切割NTR敏感连接子，从而实现PROTAC在缺氧肿瘤内的局部释放，并通过全身给药显著抑制"脱靶"毒性。

本研究开发了一种双靶点治疗平台，命名为hrFP-E，其整合缺氧响应型 (hr) FAK PROTAC (FP) 与EGFR抑制剂Erlotinib。研究人员证明hrFP-E仅被缺氧激活以高效降解FAK，并相较于传统FAK抑制剂 (FAKi) 展现出更优的机械转导抑制。此外，hrFP-E通过同时降解FAK和抑制EGFR信号，在缺氧条件下对非小细胞肺癌 (NSCLC) 细胞发挥协同抗迁移和抗增殖效应。据研究人员所知，这是首个工程化具有肿瘤特异性触发以实现时空机械-化学抑制的PROTAC实例。最后，在人NSCLC细胞与基质成纤维细胞共植入小鼠模型中，hrFP-E通过体内机械-化学协同显著增强治疗效果。

研究人员首先合成FAK PROTAC (FP)，其在剂量依赖方式下有效降解FAK。研究人员评估了缺氧和常氧条件下FAK降解和抑制的半数抑制浓度 (IC₅₀₅₀=6.624 μM vs. FAKi的IC₅₀=4.311 μM)。然而，在缺氧条件下，两种治疗的细胞抑制效率紧密一致 (FP的IC₅₀=1.782 μM vs. FAKi的IC₅₀=1.757 μM)，提示FP在缺氧TME中特别有效。缺氧的核心响应因子HIF-1α及其下游基因 (GLUT1、PKM) 在缺氧条件下表达增加，均被FAKi和极富FP处理降低。令人惊讶的是，FAKi处理增加FAK表达尽管抑制了FAK活性；相反，FP处理按预期消除了FAK表达和活性。划痕实验评估显示，FP处理在缺氧 (17% vs. 70%闭合率) 7常氧 (25% vs. 69%闭合率) 条件下均显著降低细胞运动性，而FAKi处理在缺氧条件下与对照组无显著差异。

研究人员进一步检查E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白表达水平，因其比值 (E/N比值) 指示细胞-细胞连接强度。与FAKi处理细胞E/N比值降低不同，FP处理细胞在缺氧条件下E/N比值保持不变。此外，FP处理组显示与3未处理组相比细胞收缩力意外增加，而FAKi处理组无显著变化，该收缩力增加也通过磷酸化肌球蛋白轻链 (pMLC) 上调证实。牵引力增加通常促进细胞迁移，但研究人员观察到划痕实验中的相反结果。为解释该现象，研究人员评估处理后细胞的黏着斑动态和细胞骨架结构。FP处理显著放大黏着斑数量和大小，如paxillin免疫荧光图像所示，与paxillin表达显著增加 (超过4倍) 一致。此外，FP处理细胞具有比未处理和FAKi处理细胞更厚的F-actin纤维，优先分布于细胞周边并与 enlarged 黏着斑共定位。FP去除FAK可能促进更稳定黏着斑斑块形成，尽管FP处理后细胞牵引力增加，但可能抑制细胞迁移。这些结果共同突出FAK降解与抑制在细胞功能上的显著差异，尤其在不同氧条件下。

基于缺氧区域NTR表达升高是缺氧标志性特征，研究人员选择NTR触发FP和Erlotinib (EGFR突变的靶向治疗药物) 释放。研究人员开发了缺氧响应型(hr) PROTAC化合物hrFP-E，其在NSCLC组织中精确降解FAK并抑制EGFR。该合理设计通过引入三功能连接子屏蔽PROTAC活性，阻碍关键的E3连接酶-底物-PROTAC三元复合物形成。在缺氧TME中，升高的NTR激活hrFP-E，从而以机械-化学方式协同杀伤癌细胞。

研究人员通过从胺基连接子二氨基二丙胺延伸NTR响应基序 (缺氧敏感) 设计缺氧响应组分Erlotinib_NTR，进一步连接Erlotinib。Erlotinib_NTR与Erlotinib (-7.53 kcal mol^-1) 类似，与EGFR具有良好亲和力 (-5.87 kcal mol^-1)。Erlotinib_NTR有效降低EGFR和磷酸化EGFR蛋白水平，但其IC₅₀值从Erlotinib的20.84 μM略微增加至25.82 μM，归因于PROTAC臂的影响。

为阐明hrFP-E的结合动态和激活机制，研究人员通过亲和力和激活模拟评估，检测hrFP-E延伸基团抑制与靶蛋白 (FAK、CRBN和EGFR) 形成三元复合物的能力。分子对接模拟结果表明，与FAKi (-4.31 kcal mol^-1) 和沙利度胺 (-9.19 kcal mol^-1) 相比，FP对FAK (-1.79 kcal mol^-1) 和CRBN (-3.47 kcal mol^-1) 的结合亲和力降低。此外，hrFP-E与FAK (7.16 kcal mol^-1) 和CRBN (5.83 kcal mol^-1) 蛋白结合不稳定。表面等离子体共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR) 进一步观察到hrFP-E延伸基团结合能力显著降低，FAK的K_D值从0.608 μM升至1.87 μM，CRBN的K_D值从0.274 μM升至1.59 μM，与分子对接数据一致，突出FP对FAK亲和力的降低。类似地，hrFP-E与EGFR蛋白也表现出降低的结合亲和力 (810.56 kcal mol^-1) 和能力 (5.86 μM)。然而，由于PROTAC独特的催化机制，FP与FAK亲和力的降低几乎未破坏其相对于FAKi降解FAK的能力。

为验证hrFP-E被硝基还原酶 (NTR) 激活，研究人员使用高效液相色谱 (HPLC) 和质谱 (MS) 分析hrFP-E在不同NTR剂量下的化学转化。NTR诱导反应高效地将hrFP-E的硝基转化为氨基，通过自消除1,6-消除反应促进连接的PROTAC和药物组分释放。hrFP-E显示出优异的选择性和时间依赖性降解动力学，48小时内约86%的FP (m/z = 924.30) 和Erlotinib_NTR (m/z = 644.26) 被释放，表明hrFP-E能够以可控、稳定和位点特异性方式同时执行药物释放和蛋白降解。

hrFP-E通过内体/溶酶体途径进入细胞质并执行持续的FAK降解和EGFR抑制。为验证hrFP-E的缺氧特异性激活，研究人员首先评估常氧条件下的脱笼效率。笼蔽的hrFP-E不改变细胞FAK、磷酸化FAF (pFAK) 或pEGFR蛋白表达，也不影响细胞功能如迁移和活力，表明hrFP-E在常氧条件下的惰性。hrFP-E积极缺氧响应并以剂量依赖方式降解FAK和pFAK。12小时内，5 μM浓度下降解效率FAK和pFAK均约99%，1 μM时约98%和97%，0.5 μM时约96%和94%。此外，hrFP-E比单独Erlotinib更有效地抑制pEGFR，暗示协同治疗效应。与Erlotinib仅45%抑制相比，hrFP-E在5 μM 12小时实现约88%抑制，且在缺氧条件下可持续72小时。

缺氧诱导的hrFP-E激活显著降低二维和三维细胞迁移。同时，hrFP-E处理组活性氧 (ROS) 水平显著增加 (约31.6倍)，相比单药处理组 (FAKi约9.2倍；FP约14.8倍；Erlotinib约1.5倍)。由于ROS水平深刻影响细胞生长，研究人员进一步检查hrFP-E对细胞增殖和活力的影响。激活的hrFP-E显示出增强的细胞毒性，IC₅₀为2.6 μM，S-G2-M期细胞比例降低，突出其在缺氧条件下的优越疗效。有趣的是，研究人员还观察到激活的hrFP-E以剂量依赖方式有效减少胶原沉积，这可能源于FP对COL1A1 (I型胶原) 的显著下调。此外，hrFP-E处理细胞在缺氧条件下显示增加硬度，可能抑制转移。这些结果证明hrFP-E对缺氧TME的敏感特异性响应，以及通过FAK降解增强NSCLC细胞治疗反应的协同效应。

为评估hrFP-E体内抗肿瘤疗效，研究人员对裸鼠进行H1975和MRC5细胞移植实验。小鼠随机分组，每三天腹腔注射一次hrFP-E或对照治疗，共六个周期，持续21天。与单一治疗组相比，hrFP-E显著抑制肿瘤生长约66%，且研究期间无死亡或小鼠显著体重减轻。与体外结果一致，hrFP-E和FP处理组的组织硬度降低通过储存模量降低证实。研究人员通过Masson染色进一步验证hrFP-E对体内胶原产生和沉积的负调控，观察到hrFP-E处理后肿瘤组织中胶原纤维密度明显减少。组织病理学染色证实重复hrFP-E给药有效抑制肿瘤细胞增殖，且无显著主要器官损伤。相反，Erlotinib和FAK抑制剂均引发肝脏明显损伤。体内hrFP-E的成功激活和活性组分释放通过FAK显著降解 (51%降解率) 和EGFR抑制 (75%抑制率) 证实。这些发现突出hrFP-E作为有效且安全的缺氧靶向肿瘤治疗候选药物的潜力。

研究人员开发的缺氧激活PROTAC展示了肿瘤特异性的创新工程解决方案。通过整合生物还原触发器NTR，研究人员创建了在缺氧肿瘤内精确控制FAK降解的前药。这种PROTAC的空间控制克服了脱靶毒性，这是PROTAC治疗因正常器官中"不受控"蛋白降解而产生的主要局限之一。与需要仔细滴定或间歇给药以管理毒性的临床联合研究不同，研究人员的缺氧触发方法旨在将活性药物限制在肿瘤微环境中，可能避免此类剂量限制性全身毒性。通过将缺氧激活与PROTAC介导的蛋白降解偶联，研究人员利用更精确和催化性的靶蛋白降解，只要其保留在缺氧肿瘤中，就在局部放大效应而不持续暴露正常细胞。体内结果验证了环境特异性PROTAC可拓宽治疗窗口。FP在缺氧条件下比在常氧条件下表现出更强的抑制作用，可能因其不仅抑制基础FAK活性，还对抗缺氧增强的FAK激活和FAK非酶促功能介导的潜在信号代偿。从工程学角度，这证明了构建响应肿瘤特异性化学信号的智能治疗药物的可行性，该策略可扩展至响应其他病理线索 (如升高ROS、磷酸酶、H₂S) 的其他笼蔽库。

作为关键机械转导器，FAK可响应肿瘤机械微环境 (Tumor Mechanical Microenvironment, TME) 并激活各种信号通路以调节肿瘤细胞的治疗反应。尽管FAKi可有效阻断激酶依赖性信号，但这些抑制剂不干扰FAK的非激酶功能，后者已被公认在调节肿瘤细胞治疗反应中发挥作用。研究工作的核心发现是，通过蛋白水解 (FP) 完全去除FAK比单独FAK激酶抑制 (FAKi) 产生更优越的肿瘤机械转导干扰。首先，代偿机制在单个小分子抑制场景中广泛存在。如研究所观察，缺氧条件下FAKi处理细胞显示pFAK信号轻微降低和总FAK水平增加 (可能由于FAK自降解减少或黏着斑稳定性增加)。相反，PROTAC介导的降解消除FAK，其坍塌黏着斑支架，消除依赖于FA支架的FAK代偿通路。此外，通过降解FAK，研究人员还可能干扰FAK的表观遗传调控，这是FAKi无法实现的。体外数据支持这一点，仅FP处理肿瘤细胞显示paxillin和pMLC的显著上调，表明更广泛的FAK功能被遏制。其次，数据显示FAK抑制未能逆转缺氧条件下肿瘤细胞的机械侵袭表型。FAKi处理肿瘤细胞维持高细胞硬度、强牵引力和广泛黏着斑，与未处理细胞相似。这突出FAK在黏着斑蛋白束中的显著结构作用，即使无酶活性。这与先前研究发现一致，即催化失活FAK可保留在黏着位点调节黏着斑周转。此外，这些处理诱导的细胞收缩、肌动蛋白束形成和黏着斑大小增加可能激活促进HIF-1α表达的FAK非依赖性上游通路，如PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK，导致FAKi和FP处理后HIF-1α上调。这些结果共同强调设计治疗药物时考虑靶蛋白非酶促作用的重要性，表明蛋白降解剂可能在抑制剂失败之处取得成功。

尽管已有二十多种FAKi处于研究和临床前阶段，单独抑制FAK未能提供显著治疗优势。多项临床前试验显示FAKi与其他治疗药物联合的增强疗效，如细胞周期、MEK1/2、STAT3、BRAF抑制剂和免疫调节抗体。本研究 demonstrates 通过同时靶向生长信号受体 (EGFR) 和机械转导器 (FAK) 对癌细胞进行协同攻击，尤其在缺氧环境背景下。EGFR和FAK在独立但相互关联的信号网络中运作，联合抑制在模型中证明比单药治疗显著更有效。体内FAKi治疗表明EGFR和FAK信号之间的串扰通过Src依赖性机制减少EGFR磷酸化。多个团队已提出各种基于PROTAC的公式靶向FAK蛋白，但在协同抑制疗效方面未取得重大进展。与FAKi相比，FP处理在体内表现出较差的治疗效果，可能源于FP诱导激活不 solely 依赖FAK的存活和增殖通路。增加的黏着斑大小和细胞收缩力均可促进存活和增殖信号，从而减弱FP的抗肿瘤效力。例如，MAPK/ERK通路可在肌动蛋白应力纤维上以收缩力依赖性方式激活。整合素可诱导EGFR磷酸化并促进癌细胞增殖。尽管研究人员未对双抑制FAK和EGFR的协同分子机制进行彻底研究，但数据确实表明hrFP-E对肺癌抑制的协同效应源于缺氧条件下NSCLC细胞迁移和增殖的抑制。这些见解强化了生化与机械生物协同抑制可通过同时坍塌肿瘤维持的多重支柱产生协同治疗效应的概念。

研究工作 exemplifies 如何将机械生物学和生物化学原理融合以创建创新疗法。通过协调靶向机械信号轴 (整合素-FAK) 与化学生长信号 (EGFR)，研究人员拥抱了癌症治疗的机械-化学范式。在实践中，这可能意味着将靶向抑制剂 (针对驱动癌基因) 与机械生物学导向治疗 (如FAK降解剂) 相结合。治疗降低肿瘤细胞外基质硬度和黏着斑形成的事实令人瞩目，因其表明研究人员不仅杀伤肿瘤细胞，还积极将TME"重编程"至有利于促进肿瘤细胞治疗反应性的有益状态。这种双靶点治疗使具有致密细胞外基质或缺氧核心的肿瘤获益，将基质硬度和恶劣环境转化为肿瘤细胞的机械-化学脆弱性。

从工程学和药物设计角度，研究展示了下一代治疗药物的通用框架。hrFP-E分子可视为功能组件的模块组装：FAK的靶标识别配体、EGFR的分子抑制剂、E3连接酶募集配体，以及调节活性的缺氧敏感连接子。每个模块可优化或替换——例如，可掺入替代抑制剂以消除其他致癌蛋白的活性 (如BRAF)，或使用具有可调触发阈值的不同缺氧不稳定基团。这种模块性意味着研究人员可通过插入适当的靶向配体快速设计用于不同癌症类型的PROTAC，同时保持使用缺氧 (或其他肿瘤特异性因素) 激活的相同范式。在本研究中，研究人员通过在同一背景下部署缺氧激活的EGFR抑制和FAK蛋白水解实现了双靶向，但未来设计甚至可能在一个分子中 tether 两个弹头用于PROTAC降解，前提是可找到合适的化学方法。hrFP-E作为成功概念验证，说明即使小分子治疗药物也可被赋予逻辑门控激活。类似于目前正在研究的缺氧响应纳米颗粒，这为生物工程师开辟了新途径：设计在特定酶、pH水平或疾病组织独特代谢状态下激活的PROTACs、前药、抗体药物偶联物和生物材料，以实现个性化治疗。

研究发现对临床转化和患者护理具有令人鼓舞的意义。缺氧激活双降解剂的协同疗效和明显安全性表明，该策略可克服肿瘤学中两个 perennial 问题：单药治疗疗效不足和联合方案不可耐受的毒性。临床医生日益意识到联合方法的必要性——正如近期试验将FAK抑制剂或胶原酶加入靶向或免疫治疗所示——但一直 struggled 于药物相关不良事件。特定环境疗法可允许患者接受更积极的多通路治疗，同时减少副作用，改善治疗期间生活质量。尽管在正常氧合组织中已确认最小药物激活，但需要在高级模型和非人类灵长类动物中进行仔细的毒理学研究，以排除人类给药的任何细微脱靶效应。令人鼓舞的是，雄激素受体PROTAC ARV-110和雌激素受体PROTAC ARV-471已进入人体试验，并分别在前列腺癌患者和乳腺癌患者中显示出良好的耐受性和临床获益。这些成功意味着缺氧激活PROTACs可能成为未来精准肿瘤药物的模板，为目前逃避最佳单靶点治疗的难治性肿瘤患者带来新希望。

研究结论指出，研究人员引入一种缺氧激活的双弹头PROTAC，其降解FAK并抑制EGFR以空间精度递送机械-化学治疗。以肺癌为示范，hrFP-E在缺氧条件下实现近乎完全的FAK消除、强效的EGFR抑制、显著的抗迁移/抗增殖效应、细胞外基质软化，以及无显著毒性的体内疗效。该平台可推广至其他致癌驱动因子和病理开关，为实体瘤机械医学建立蓝图：在肿瘤缺氧生存之处，共同重布线肿瘤力学和生长信号。