蛋白质组学分析揭示遗传性痉挛性截瘫痉挛蛋白模型中皮质脊髓运动神经元早期病理缺陷，并可通过NU-9治疗改善

《Neurobiology of Disease》：Proteomic analysis reveals early pathological defects in corticospinal motor neurons of a spastin model of hereditary spastic paraplegia, which are improved by NU-9 treatment

　　

上运动神经元（UMN）变性是遗传性痉挛性截瘫（HSP）的特征，这是一种由九十多个基因突变引起的遗传异质性遗传性神经退行性疾病。SPAST基因（编码微管切割蛋白痉挛蛋白）的突变导致约40%的HSP病例。迄今为止，突变痉挛蛋白与HSP患者UMN脆弱性之间的细胞和分子机制仍然未知，并且尚无疾病修饰疗法。为解决这一知识空白，研究人员从SPAST^C448Y-UeGFP报告小鼠的两个症状前时间点分离出纯净的皮质脊髓运动神经元（CSMN；在小鼠中亦称UMN）群体，并进行了自下而上（bottom-up）的蛋白质组学分析，以揭示其蛋白质组（proteome）的变化，从而阐明其初始脆弱性的潜在原因。研究人员发现CSMN蛋白质组存在动态变化，并且细胞结构完整性（cytoarchitectural integrity）和关键细胞器稳定性方面的限制是导致其神经元脆弱性（neuronal vulnerability）的因素。鉴于化合物NU-9已被证明能改善由错误折叠的SOD1毒性（misfolded SOD1 toxicity）和TDP-43病理（TDP-43 pathology）引起的CSMN疾病中的类似细胞问题，研究人员进一步研究了其对SPAST^C448Y小鼠中重现的HSP已确立病理特征的影响。研究人员发现NU-9治疗（100?mg/kg，持续100天）显著阻止了皮质脊髓轴突（corticospinal axons）的变性，恢复了线粒体（mitochondria）和内质网（ER）的完整性，并减少了SPAST^C448Y小鼠CSMN中电子致密聚集物（electron-dense accumulations）的存在。

**研究背景、目前存在的问题和研究必要性**

上运动神经元（UMN），又称皮质脊髓运动神经元（CSMN），在自主运动的启动和调节中扮演着关键角色，并在多种运动神经元疾病中受到主要影响，包括遗传性痉挛性截瘫（HSP）、原发性侧索硬化症（PLS）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）。尽管这些疾病都涉及UMN变性，但导致UMN脆弱性和进行性变性的具体细胞和分子机制仍不明确。揭示这些信息对于理解不同疾病中UMN脆弱性的细胞基础以及开发有效治疗策略至关重要。

获取来自全脑提取物的可靠细胞数据极具挑战性，尤其是在大脑中只占极小比例的特定神经元群体（如CSMN，仅占运动皮层第5层，不足大脑皮层的1%）中，阐明细胞事件的机制性见解更为困难。然而，CSMN的变性是HSP、PLS和ALS的特征性病理，这使得它们成为临床上重要的神经元群体，因此揭示导致其选择性脆弱性的潜在机制变得至关重要。

迄今为止，已有90多个基因突变被证实与HSP相关，其中SPAST基因的突变约占所有HSP患者的40%，使其成为研究CSMN在HSP中脆弱性机制的关键靶点。SPAST基因编码微管切割蛋白痉挛蛋白（spastin），该蛋白参与调节微管动力学以及线粒体和内质网（ER）等关键细胞器的完整性。研究人员利用了SPAST^C448Y小鼠模型，该模型表达带有HSP相关C448Y突变的外源性人SPAST基因，并已被证实能重现HSP的多个关键临床特征，使其成为理想的研究模型。为了将研究重点从整体小鼠转移到患病神经元，研究人员结合了UCHL1-eGFP小鼠（其中CSMN被荧光标记）和SPAST^C448Y小鼠，生成了SPAST^C448Y-UeGFP小鼠，这是一个HSP疾病模型，其中CSMN表达eGFP荧光。通过荧光激活细胞分选（FACS）策略，可以从复杂的脑组织中分离出纯净的CSMN群体，从而实现对这些神经元的精确细胞和分子分析。利用蛋白质组学方法来理解潜在的疾病机制正日益受到关注。

**研究人员开展了什么研究，得出什么结论，有什么重要意义，论文发表在《Neurobiology of Disease》**

本研究中，研究人员从SPAST^C448Y-UeGFP小鼠的两个早期症状前时间点（P60和P90）分离出纯净的CSMN群体，并进行了自下而上（bottom-up）的蛋白质组学分析，旨在揭示导致CSMN初始脆弱性的细胞和分子基础。研究结果表明，这些脆弱的CSMN的蛋白质组（proteome）存在动态变化，并且细胞结构完整性（cytoarchitectural integrity）以及关键细胞器（如线粒体和内质网）稳定性的缺陷是导致其神经元脆弱性（neuronal vulnerability）的关键因素。鉴于化合物NU-9先前已被证明能改善由错误折叠的SOD1毒性（misfolded SOD1 toxicity）或TDP-43病理（TDP-43 pathology）引起的CSMN的类似细胞问题，研究人员进一步探讨了NU-9对SPAST^C448Y小鼠中HSP已确立病理特征的影响。研究人员发现，NU-9治疗（100 mg/kg，持续100天）显著预防了皮质脊髓轴突（corticospinal axons）的变性，恢复了线粒体和内质网的完整性，并减少了SPAST^C448Y小鼠CSMN中电子致密聚集物（electron-dense accumulations）的存在。

这些发现不仅为理解SPAST^C448Y突变导致的UMN选择性脆弱性的细胞和分子基础奠定了坚实基础，而且有助于开发以机制为导向的药物发现策略，即识别并开发能够预防常见细胞病理事件的化合物，以帮助在不同疾病中表现出选择性脆弱性的神经元。临床前研究表明NU-9治疗可减少皮质脊髓轴突变性，并改善SPAST^C448Y小鼠CSMN中关键细胞器的稳定性和完整性。这些结果为未来更深入的功能改善和有效转化研究开辟了道路。本论文发表在《Neurobiology of Disease》杂志。

**主要关键的技术方法**

为了开展这项研究，研究人员首先构建了SPAST^C448Y-UeGFP报告小鼠模型，通过将表达C448Y突变人SPAST基因的SPAST^C448Y小鼠与表达eGFP的UCHL1-eGFP小鼠杂交，使得HSP疾病背景下的CSMN能够特异性地表达eGFP荧光。随后，研究人员在小鼠的症状前时间点P60和P90，通过精细的显微解剖从运动皮层分离组织，并通过酶消化和机械解离制备单细胞悬液。接着，利用荧光激活细胞分选（FACS）技术，根据eGFP荧光信号以及细胞大小和散射特性，高效分离出纯净的CSMN群体。对这些纯化的CSMN样本，研究人员进行了自下而上（bottom-up）的蛋白质组学分析，通过质谱（Mass Spectrometry, MS）技术识别和量化差异表达的蛋白质。同时，使用Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 软件对蛋白质组数据进行生物信息学分析，以揭示潜在的信号通路、疾病和生物学功能。此外，研究人员还采用了免疫细胞化学（Immunocytochemistry）方法对特定蛋白质的表达进行验证。最后，通过透射电子显微镜（Electron Microscopy, EM）对CSMN的细胞体和皮质脊髓束（Corticospinal Tract, CST）轴突进行超微结构观察，以可视化病理变化，并定量评估电子致密聚集物、线粒体和内质网的完整性以及轴突的结构状态。

**研究结果**

* **SPAST^C448Y小鼠CSMN的蛋白质含量呈动态变化**
研究人员通过将UCHL1-eGFP小鼠与SPAST^C448Y小鼠杂交，成功构建了WT-UeGFP（健康对照）和SPAST^C448Y-UeGFP（患病）小鼠模型，其中CSMN表达eGFP荧光。在P60和P90两个症状前时间点，研究人员通过FACS纯化得到CSMN，并进行了自下而上（bottom-up）的蛋白质组学分析。结果显示，SPAST^C448Y-UeGFP小鼠CSMN中的痉挛蛋白（spastin）水平显著升高。蛋白质组学分析揭示，在P60时，患病CSMN中有183种蛋白质与健康CSMN存在显著差异；到P90时，有176种蛋白质表现出显著差异。值得注意的是，P60和P90之间，约93%的差异表达蛋白质没有重叠，表明在症状发生前，CSMN中的细胞事件具有动态性。免疫细胞化学分析进一步证实了某些差异表达蛋白质（如ATPAF2、ALDH3A1、NCOA2和CACNG7）在CSMN中的表达模式。

* **患病CSMN在P60和P90的关键信号通路不同**
通过Ingenuity Pathway Analysis (IPA) 的通路分析，研究人员发现P60和P90的CSMN中活跃的典型通路存在显著差异。在P60，电压门控钾离子通道（K⁺通道，即Kcnab2、Kcnd3、Kcnj10和Kcnq5）活性潜在上调，提示可能存在兴奋性改变。线粒体中克雷布斯循环（Kreb's cycle，即三羧酸循环，TCA cycle）相关蛋白（如Sdhaf4、Nfs1、Iscu和Fxn）表达增加，表明细胞试图上调TCA循环以应对能量限制。Rho GTPase相关细胞事件也突出，涉及多个上调和下调蛋白。此外，研究人员检测到CLEAR信号通路（通过上调Prkab1和Wdr45）被激活，提示细胞可能试图维持内环境稳态。然而，微自噬（microautophagy）信号通路可能下降（例如Psmd2、Psmd3、Psmd12、Psmd13、Sec13和Vps37c下调），这可能与早期细胞内碎片积累有关。
到P90时，主要的典型通路转变为RAB香叶基香叶酰化（RAB geranylgeranylation）通路（Rab2a、Rab4b、Rab5b和Rab5c蛋白表达增加），该通路与膜结构和功能维持相关。突触发生信号通路（Synaptogenesis signaling pathway）也显著突出（Efnb3、Lyn、Plcg1、Rab5b、Rab5c、Rras和Syt12蛋白表达增加），提示突触功能可能受损。

* **P60和P90患病CSMN中疾病相关细胞功能的比较**
比较两个时间点与疾病相关的细胞功能，研究人员发现两个主要的细胞脆弱性事件：一是细胞骨架（cytoarchitecture）和微管动力学（microtubule dynamics）的组织问题，这在P60已经出现并在P90加剧，表明患病CSMN难以维持其细胞骨架完整性，轴突缺陷在P90变得显著，并且有轴突再生的尝试。二是线粒体和内质网（ER）的功能障碍，这主要在P90被检测到，表现为脂肪酸和脂质氧化增加、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生增多以及Ca²⁺细胞内流增加，这些都暗示线粒体功能受限和能量代谢问题。这些细胞功能障碍提示线粒体和ER可能存在功能缺陷。

* **电子显微镜分析揭示细胞病理学，并与蛋白质组学变化相关联**
研究人员利用电子显微镜（EM）详细观察了患病CSMN的胞体和轴突。在SPAST^C448Y小鼠的CSMN胞体中，发现了大量不同大小和形状的电子致密聚集物，而在健康小鼠中则很少或没有。患病CSMN的线粒体显示内线粒体膜受损，而健康CSMN的线粒体则完整。此外，患病CSMN的内质网完整性受损，表现为内质网池（ER cisternae）缩短、断裂和肿胀。这些细胞缺陷在P120的健康CSMN中未观察到，表明它们并非主要与年龄相关。

* **NU-9改善SPAST^C448Y-UeGFP小鼠CSMN的潜在致病因素**
鉴于NU-9在改善由错误折叠SOD1毒性和TDP-43病理引起的CSMN蛋白质聚集、线粒体结构和ER完整性方面的效果，研究人员进一步探讨了NU-9对SPAST^C448Y-UeGFP小鼠CSMN中类似细胞问题的治疗作用。WT和SPAST^C448Y小鼠从P100开始，每天口服NU-9（100 mg/kg，每周5天）持续100天，至P200结束。
结果显示，NU-9治疗后，线粒体和内质网的结构得到了显著改善，电子致密聚集物的数量也显著减少。具体而言，NU-9治疗使得患病CSMN中的完整ER池数量显著增加，受损线粒体的百分比显著降低，并且与健康CSMN相比，轴突变性程度得到缓解，轴突纤维数量恢复到接近健康水平。此外，NU-9治疗显著减少了患病CSMN皮质脊髓束轴突的肿胀，并改变了轴突直径的百分比分布，增加了未肿胀轴突的比例，减少了肿胀轴突的出现。

**总结讨论部分及研究结论**

讨论部分强调了在研究复杂且异质的脑部疾病（如HSP）时，对特定神经元群体（如UMN/CSMN）进行直接和精确评估的重要性，而非仅仅依赖均质化的脑组织提取物。研究人员再次强调了SPAST^C448Y-UeGFP小鼠模型与FACS介导的CSMN分离技术在揭示细胞类型特异性问题方面的优势。

蛋白质组学分析揭示了患病CSMN蛋白质含量的动态变化，甚至在30天内就发生了巨大改变，这凸显了脆弱神经元在疾病进展过程中细胞事件的动态性质。讨论深入探讨了在症状前阶段（P60和P90）检测到的主要细胞缺陷：P60时，电压门控K⁺通道活性的改变可能导致兴奋性过高，而TCA循环的调控暗示能量代谢的限制和线粒体问题。微自噬的减少可能解释了电子致密聚集物的早期出现。Rho GTPase循环的紊乱则持续存在于P60和P90，影响细胞骨架和膜相关过程。P60时CLEAR信号通路的激活可能代表了脆弱神经元在早期阶段促进生存的尝试。P90时，RAB香叶基香叶酰化和突触发生信号通路的出现表明膜结构、囊泡动力学和突触通讯面临新的挑战。IL-8和IL-15信号通路的激活提示免疫反应可能在P90的症状前阶段启动。这些细胞问题在P60到P90之间逐渐增加，尤其体现在细胞骨架组织、微管动力学以及线粒体和内质网功能障碍上。

最重要的是，研究人员强调了SPAST^C448Y小鼠中CSMN的脆弱性表现出许多与由错误折叠SOD1毒性和TDP-43病理引起的CSMN变性相似的共同特征，如电子致密聚集物、线粒体和细胞骨架解体。这些共性强调了精确研究疾病细胞的重要性，并为构建针对广泛神经退行性疾病的更强大有效的治疗策略提供了可行性。

研究人员指出，NU-9这种小分子药物能够在三种不同的疾病模型中（包括本文的HSP模型和之前的ALS模型）对CSMN显示出相似的治疗效果，甚至在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）模型中也显示出作用，这提示NU-9可能靶向多种神经退行性疾病中共同存在的潜在致病机制。虽然本研究基于表型筛选，未能识别NU-9的结合伴侣或详细作用机制，但通过FACS纯化特定神经元群体、直接进行蛋白质组学分析、EM验证以及化合物干预的综合方法，大大增强了生物学结论的可靠性。NU-9已获得FDA批准启动ALS治疗的I期临床试验，其在SPAST基因突变引起的CSMN神经元脆弱性中改善四种主要潜在致病因素的能力是显著的。未来的研究将需要更大的队列来深入探讨NU-9的作用机制，并识别靶点结合生物标志物和药代动力学（pharmacokinetic）生物标志物，以指导CSMN改善的时机和程度。研究人员预计，以机制为导向的药物发现工作将在未来几年占据中心地位，针对不同神经退行性疾病中共同问题的化合物将被研究，以期产生广泛的影响。

研究结论：
我们的研究结果不仅为明确理解SPAST^C448Y突变导致UMN选择性脆弱性的细胞和分子基础奠定了坚实基础，而且有助于开发以机制为导向的药物发现工作，在此类工作中，识别和进一步开发可预防常见细胞病理事件的化合物，以帮助那些在不同疾病中显示选择性脆弱性的神经元。临床前研究表明，NU-9治疗可减少SPAST^C448Y小鼠CSMN中皮质脊髓轴突变性，并改善关键细胞器的稳定性和完整性。这些结果为未来更详细的功能改善和有效的转化努力研究开辟了道路。