海藻酸钙与羧甲基纤维素伤口敷料浸提液对人感觉神经元再生及分泌组(Differential Effects of Calcium Alginate and Carboxymethylcellulose Wound Dressing Extracts on Human Sensory Neuron Regeneration and Secretome)

《Wound Repair and Regeneration》：Differential Effects of Calcium Alginate and Carboxymethylcellulose Wound Dressing Extracts on Human Sensory Neuron Regeneration and Secretome

　　

摘要：外周神经系统对伤口愈合至关重要，感觉神经释放神经肽以驱动组织修复。感觉神经损伤会损害愈合并促进慢性伤口的形成（如糖尿病神经病变中所见），然而高级伤口敷料对外周神经的影响尚未被探讨。筛选出能促进神经再生的敷料将有助于复杂伤口的处理。本研究探讨了三种伤口敷料浸提液对人感觉神经元的体外影响：纯海藻酸钙敷料（Alginate）、海藻酸钙与羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose, CMC)混合敷料及纯CMC敷料。研究人员将神经祖细胞来源的感觉神经元暴露于敷料浸提液中5天，评估细胞活力、轴突切断后的突起再生(neurite regeneration)及神经球(neurosphere)的突起向外生长(neurite outgrowth)，并在隔室化微流控芯片(compartmentalised chip)中仅将浸提液加至突起隔室以评估突起延伸(neurite extension)。结果显示仅Alginate在各测试浓度下均无细胞毒性；在轴突切断模型中，Alginate与CMC保留了突起再生能力，而混合敷料损害再生；在神经球模型中，Alginate显著促进突起向外生长，CMC无影响，混合敷料抑制向外生长；此外，Alginate上调神经营养及促修复因子如脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的分泌，而CMC与混合敷料多下调关键因子；在隔室化培养中，Alginate有促进突起延伸的趋势，CMC维持原有水平，混合敷料导致突起回缩。上述结果表明纯海藻酸钙敷料支持神经修复——这对神经性伤口的愈合至关重要——并可能解释其在复杂伤口中良好的临床表现。

论文解读：海藻酸钙与羧甲基纤维素伤口敷料浸提液对人感觉神经元再生及分泌组的影响

研究背景与目的

慢性伤口是全球重大临床挑战，糖尿病患者因感觉神经病变（周围神经病）导致伤口愈合延迟及溃疡风险升高。皮肤感觉神经末梢通过释放P物质(Substance P, SP)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)等神经肽调控免疫细胞功能、血管生成、胶原重塑及细胞迁移，是有效伤口愈合的关键。然而既往对高级伤口敷料的评价多集中于角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞或免疫细胞，敷料对外周神经系统(peripheral nervous system, PNS)的影响在近10年文献中尚无报道。鉴于海藻酸盐敷料因高吸湿性与Ca²⁺离子释放广泛用于渗出性急慢性伤口（如糖尿病足溃疡），研究人员假设不同敷料组成可能差异性地影响感觉神经元存活、突起再生及神经分泌活动，因此选用三种常用非封闭性敷料——纯海藻酸钙（Algostéril）、海藻酸钙混合羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose, CMC)（Biatain Alginate）及纯CMC水纤维敷料（Aquacel Extra）——通过多种体外模型评估其对人诱导感觉神经元(induced sensory neurons, iSN)的作用，以明确何种敷料有利于神经修复进而辅助复杂伤口愈合。

主要技术方法

研究人员采用人诱导多能干细胞来源的神经祖细胞(neural progenitor cells, NPCs, PCi-NPC_PC069)，经DAPT与CHIR99021诱导分化为iSN并成熟培养。按ISO 10993-12:2012标准制备三种敷料浸提液（提取比例100 mg/mL，30%与50%工作浓度），测定浸提液中Ca²⁺浓度。主要实验模型包括：(1) 细胞活力检测（Calcein AM荧光法）；(2) 轴突切断(axotomy)模型模拟神经元损伤后突起再生；(3) 三维神经球(neurosphere)模型评估突起向外生长；(4) 隔室化微流控芯片（NETRI DuaLink三隔室芯片）仅将浸提液加至含突起的远端隔室以模拟敷料接触神经末梢；(5) 酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测SP与CGRP分泌；(6) 人类细胞因子抗体芯片(Human Cytokine Array C5)分析80种分泌因子变化。统计采用Mann–Whitney检验，p<0.05为显著差异。

研究结果

3.1 敷料浸提液的细胞毒性(Cytotoxicity of the Dressing Extracts)

在30%和50%浓度下，仅纯海藻酸钙（Algostéril）浸提液在两种浓度下细胞活力均高于70%无细胞毒性阈值；Aquacel Extra（纯CMC）在50%时有细胞毒性；Biatain Alginate（混合敷料）即使在30%也显示高细胞毒性。后续实验统一采用30%浸提液以保证各组成活率。

3.2 浸提液中钙离子释放(Calcium Release in Extracts)

30%浸提液中Algostéril释出Ca²⁺为11.34 mM，Biatain Alginate为17.85 mM，对照培养基为1.36 mM，Aquacel Extra为0.95 mM。证实含藻酸盐敷料释放Ca²⁺，且混合敷料因成分比例与藻酸盐中甘露糖醛酸/古洛糖醛酸比值不同而释放更高。

3.3 敷料浸提液对突起再生的影响(Effect of Dressing Extracts on Neurite Regeneration)

轴突切断模型培养5天后，Algostéril与Aquacel Extra组成活率正常且突起总数、分支节点数、覆盖面积及总突起长度与对照组无差异（保留再生能力），Biatain Alginate组四项指标均显著低于对照组，表明混合敷料抑制损伤后突起再生，与其细胞毒性一致。

3.4 敷料浸提液对突起向外生长的影响(Effect of Dressing Extracts on Neurite Outgrowth)

三维神经球模型培养5天，Algostéril组突起数量、分支节点、覆盖面积及总突起长度均显著高于对照组，证明纯海藻酸钙促进新突起向外生长与神经网络复杂化；Aquacel Extra组与对照无差异（中性）；Biatain Alginate组显著抑制各指标。

3.5 敷料浸提液对神经肽、细胞因子及生长因子分泌的影响(Effect of Dressing Extracts on Neuropeptide, Cytokine and Growth Factor Secretion)

SP与CGRP经ELISA检测，各组CGRP水平相近，Algostéril轻微（不显著）上调SP，Biatain Alginate下调SP，Aquacel Extra无影响。蛋白芯片显示Algostéril上调39种分泌因子、仅下调6种；Biatain Alginate上调7种、下调18种；Aquacel Extra上调3种、下调23种。三者均上调胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)。仅Algostéril上调BDNF、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor, LIF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)、VEGF、成纤维细胞生长因子-9(fibroblast growth factor-9, FGF-9)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)、基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1, SDF-1)及肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)等促神经再生与促修复因子；Biatain Alginate与Aquacel Extra多数情况下下调LIF、FGF家族、NT-4(neurotrophin-4)、M-CSF及SDF-1等。

3.6 隔室化培养中敷料浸提液对突起延伸的影响(Effect of Dressing Extracts on Neurite Extension in Compartmentalised Culture)

微流控芯片中仅远端突起隔室加浸提液培养5天，Algostéril组突起尖端空间扩展(neurite progression)有增强趋势（未达显著），Aquacel Extra与对照相当，Biatain Alginate引起突起回缩(regression)；突起覆盖面积(neurite area) Algostéril与Aquacel Extra同对照，Biatain Alginate组回缩，与神经球结果定性一致。

讨论与结论

既往敷料细胞相容性评价忽略PNS，本研究首次系统评估三种常用敷料浸提液对人iSN的作用。纯海藻酸钙（Algostéril）无细胞毒性、适度释放Ca²⁺（11.34 mM），促进神经球突起向外生长并上调BDNF、IGF-1、VEGF、FGF-9等神经营养与促愈合因子分泌，隔室化模型中倾向促进远端突起延伸；纯CMC（Aquacel Extra）无促生长作用但在测试浓度（30%）下维持神经元状态与再生能力，不下调多数因子；海藻酸钙/CMC混合敷料（Biatain Alginate）因较高Ca²⁺释放（17.85 mM）及潜在微量杂质呈现细胞毒性，抑制突起再生与向外生长，并使远端突起回缩，多数神经营养与修复因子分泌被下调。研究人员认为Algostéril适中Ca²⁺释放可优化细胞内钙信号从而激活突起生长与分泌机制，而过高Ca²⁺或CMC单独存在无此效应。局限性为体外模型未涵盖体内复杂微环境及敷料本体接触，未来需电生理、钙成像或在体伤口模型验证。

结论翻译（原文Conclusion浓缩）：

本研究表明伤口敷料可差异性地影响人感觉神经元存活、突起再生、突起向外生长及神经分泌活动。所评估三种敷料中，纯海藻酸钙敷料Algostéril是唯一在各测试浓度下保留神经元活力、促进突起向外生长并上调关键神经营养与伤口愈合因子（BDNF、IGF-1、VEGF及FGF-9）的敷料。这代表了一种除活化成纤维细胞与免疫细胞外的附加愈合机制，可进一步解释Algostéril在复杂性伴神经病变伤口（如糖尿病足溃疡）中的临床疗效。筛选支持周围神经再生的敷料对慢性与神经性伤口处理具重要意义，敷料非生物惰性材料，可主动影响参与组织修复的神经再生过程。