综述：氢、质子与电子：体外抗氧化活性评价方法选择的理论依据

《Results in Chemistry》：Hydrogen, protons and electrons: Rationalizing in vitro antioxidant assay selection

　　

抗氧化剂通过清除活性氧(ROS)抑制氧化应激，进而预防氧化损伤，其活性精准评估在药物、营养补充剂、食品及生物医学研究中至关重要。抗氧化作用的核心机制涉及氢原子、质子或电子的转移过程，深入理解这些机制差异是筛选适配体外评价方法的关键前提。若评价方法与抗氧化机制不匹配，将导致测量偏差、研究间可比性降低、重现性差及假阳性/假阴性结果。本文提出一种基于化学原理的结构化、机制导向的抗氧化评价方法选择框架，将评价体系的化学反应特性与化合物的结构特征、理化性质及预期氧化还原行为进行匹配。通过系统性地将抗氧化剂与适宜的体外评价方法对应，该框架旨在提升抗氧化活性测量的准确性、可靠性与可解释性，为稳健的筛选、标准化及药物发现提供支撑。

1. 1.
   引言
   氧气被称为“两面神气体”，既是维持生命所必需的物质，又因可产生活性氧(ROS)而具有潜在风险。ROS生成与机体防御机制的失衡会导致氧化应激，进而引发动脉粥样硬化、糖尿病、缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、炎症性疾病、癌症、神经退行性疾病等多种病理状态。抗氧化剂通过清除自由基抑制氧化损伤通路，已成为对抗氧化应激相关疾病的核心治疗策略。当前大量药物研发工作聚焦于识别具有抗氧化潜力的化合物，而不同化学结构的分子其抗氧化机制存在差异，主要涉及氢原子、质子或电子的转移。选用与评价机制不匹配的检测方法可能导致特定抗氧化机制无法被检出，产生假阴性结果。现有关于抗氧化评价方法的综述多局限于分析方法罗列或将其简单归类为氢转移反应(HAT)、单电子转移(SET)或混合机制体系，虽提供了方法学概述，但缺乏可操作的机制导向选择框架。本综述整合量子化学描述符、热力学原理、结构特征、动力学效应、溶剂与pH影响及基质复杂性，构建了统一的结构-机制-评价方法关联框架，将热力学与理化描述符与各类评价方法的实验行为相关联，同时批判性探讨了动力学效应、评价干扰因素、假阳性/假阴性及食品与植物提取物中的混合物与基质依赖性行为，为抗氧化评价方法的选择与解读提供更基于机制且可操作的方法学指导。
2. 2.
   氧化应激
   氧化应激源于ROS生成与机体解毒能力或损伤修复能力的失衡。ROS是一类含氧高活性分子，来源于内源性与外源性途径，其中超氧阴离子(O₂^•?)主要由线粒体有氧呼吸电子传递链的电子泄漏产生，也可由黄嘌呤氧化酶、黄素酶及活化吞噬细胞生成，并通过超氧化物歧化酶转化为过氧化氢(H₂O₂)。过氧化氢虽反应性低于超氧阴离子，但若不能被过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化系统有效清除，仍可导致细胞损伤。最具危害性的ROS是羟基自由基(•OH)，由过氧化氢与铁(Fe²⁺)、铜(Cu²⁺)等过渡金属通过芬顿反应生成，可损伤脂质、蛋白质与核酸。ROS同时参与细胞周期调控、胞内信号转导与基因表达等生理过程，正常情况下由内源性抗氧化系统（包括谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等酶类，以及谷胱甘肽、生育酚、抗坏血酸、褪黑素等非酶类物质）清除。维持ROS生成与抗氧化防御的平衡至关重要，持续过量的ROS会突破机体天然防御。膳食摄入充足的抗氧化剂可增强机体清除自由基的能力，在疾病预防中发挥重要作用。抗氧化剂通过作为自由基清除剂、氢供体、电子供体、过氧化物分解剂、单线态氧猝灭剂、酶抑制剂、增效剂及金属螯合剂发挥作用，其稳定性使其可中和自由基并降低其损伤能力。
3. 3.
   抗氧化机制
   抗氧化剂主要通过氢转移反应(HAT)、单电子转移-质子转移(SET-PT)及连续质子丢失电子转移(SPLET)三种机制清除自由基，各机制涉及不同的反应步骤与分子描述符。
   3.1 氢转移反应(HAT)
   抗氧化剂(A-H)向自由基(R•)转移一个氢原子，反应式为R• + A-H → R-H + A•。该机制的效率主要取决于杂原子-氢键的键解离能(BDE)，BDE越低表明氢原子越易捐赠，抗氧化活性越强，因此BDE是HAT机制的核心描述符。
   3.2 单电子转移(SET-PT)
   该机制分为两步：首先抗氧化剂(A-H)向自由基转移一个电子形成自由基阳离子(AH^•+)，该过程由电离能(IP)表征；随后自由基阳离子发生去质子化，由质子解离焓(PDE)控制。IP越低越有利于电子捐赠，从而增强抗氧化活性。
   3.3 连续质子丢失电子转移(SPLET)
   该机制包含三步：抗氧化剂(AH)首先失去质子形成阴离子(A^?)，由质子亲和能(PA)表征；随后阴离子向自由基转移电子形成中性自由基(A•)，由电子转移焓(ETE)控制；最后自由基与质子结合形成中性产物。PA与ETE越低，该机制下的抗氧化效能越高。
   3.4 不同实验条件下的机制交叉
   HAT、SET-PT与SPLET的主导地位高度依赖溶剂极性、氢键能力与pH。在低极性环境（如气相、苯、脂质类介质）中，中性酚类抗氧化剂优先通过HAT反应，因带电中间体难以稳定，O-H键均裂在能量上更有利；而在水、甲醇、乙醇、二甲基亚砜(DMSO)等极性质子溶剂中，质子、自由基离子与酚盐阴离子的稳定性显著增强，PA与ETE大幅降低，机制向SPLET或电子转移路径转变。pH与酸碱平衡进一步调控去质子化抗氧化物种的比例，碱性或近生理pH条件下酚盐与羧酸盐阴离子占比升高，显著降低PA与ETE，促进SPLET路径；例如异阿魏酸在生理pH下以中性/单阴离子混合物为主，主要经自由基加成与氢转移反应，而在更高pH下酚盐占比升高，新增扩散控制的SET通道。这表明抗氧化机制并非分子的固有属性，而是动态受溶剂极性、电离状态与评价条件调控。
4. 4.
   热力学描述符
   BDE、IP、PDE、PA与ETE是决定抗氧化主导机制的关键分子描述符，其值越低通常表明化合物抗氧化潜力越强，可通过密度泛函理论(DFT)等计算方法预测最有利的自由基清除机制。除前述描述符外，最高占据分子轨道(HOMO)与最低未占分子轨道(LUMO)的能量差(E_gap)也是预测分子反应性的重要参数，E_gap越低表明分子“软度”越高、反应性越强，HOMO能量越高则电子捐赠能力越强。但热力学描述符的应用存在实践局限：其数值强烈依赖计算方法（泛函、基组、溶剂模型），例如没食子酸的描述符值在不同计算方案下可产生显著差异，且同一描述符的绝对值不应孤立解读——低PDE值不必然意味着SET-PT主导，需结合总反应能与溶剂条件综合判断。此外，描述符的预测可靠性应主要用于同系物系列内的相对比较，而非跨结构无关抗氧化剂的绝对比较，需与实验评价数据结合解读。
5. 5.
   抗氧化评价方法
   体外评价方法是抗氧化潜力初步筛选的核心工具，基于机制可分为HAT类、SET-PT类与混合模式评价方法。
   5.1 基于HAT机制的体外评价方法
   此类方法通过抗氧化剂(AH)向自由基捐赠氢原子形成稳定自由基(A•)，核心结构特征是含氢键的键解离能(BDE)，BDE越低越利于氢原子转移。代表性方法包括氧自由基吸收能力(ORAC)法、总自由基捕获抗氧化参数(TRAP)法与羟基自由基规避能力(HORAC)法。ORAC法以过氧自由基(ROO•)为目标自由基，采用荧光探针监测荧光衰减曲线下面积(AUC)，反映抗氧化剂对过氧自由基的清除能力，其结果与BDE值高度相关——例如Trolox衍生物中邻位氨基取代可通过共振稳定酚氧自由基降低BDE，黄酮醇中3-羟基的BDE最低是其抗氧化活性的结构基础。TRAP法同样以过氧自由基为靶标，通过抗氧化剂延迟荧光靶标氧化的滞后期长度评估活性，抗坏血酸、α-生育酚、槲皮素、没食子酸等含酚结构与氢供体基团的化合物在该方法中表现优异。HORAC法则模拟芬顿样反应生成的羟基自由基(OH•)，通过抗氧化剂保护荧光探针免受羟基自由基淬灭评估活性，多酚类化合物如紫杉叶素、咖啡酸、鞣花酸等因高效的羟基自由基清除能力在该方法中响应良好。
   5.2 基于SET-PT机制的体外评价方法
   此类方法的第一步由电离能(IP)决定电子移除难易度，第二步由质子解离焓(PDE)控制质子释放，代表方法为CUPRAC与FRAP法。CUPRAC法通过还原蓝色铜(II)-新亚铜试剂络合物为橙色黄色铜(I)-新亚铜试剂螯合物，在450 nm处检测吸光度，可在近生理pH下检测亲水性与亲脂性抗氧化剂，含硫醇(-SH)基团的化合物因硫的高反应活性也表现出强还原能力。FRAP法在酸性条件(pH 3.6)下将Fe³⁺-TPTZ还原为Fe²⁺-TPTZ，于593 nm处检测蓝色复合物吸光度，其机制为单电子转移，例如姜黄素类似物中吡唑环与异恶唑环的电子富集特性可提升HOMO能级，促进SET-PT过程，而原姜黄素的烯醇式羟基使其在中性pH下更倾向SPLET机制。此类方法受溶剂极性与氢键能力显著影响，极性溶剂可抑制HAT机制，提升SET-PT路径占比。
   5.3 兼具HAT与SET-PT机制的体外评价方法
   DPPH与ABTS法同时包含两种机制。DPPH法利用稳定的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH•)，通过抗氧化剂捐赠电子或氢原子使其颜色由深紫变黄，在517 nm处检测吸光度变化，其反应路径可随溶剂与结构改变——酚类化合物的酚羟基O-H键BDE较低时倾向HAT，而苯胺类化合物因缺乏酸性氢更依赖SET路径。ABTS法以2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)经氧化生成的自由基阳离子(ABTS^•+)为靶标，在734 nm处检测吸光度下降，因ABTS^•+体积大、空间位阻高，更倾向检测单电子转移而非氢转移，可能低估硫醇等HAT主导型抗氧化剂的活性。
   5.4 动力学对抗氧化评价结果的影响
   评价结果不仅受热力学参数调控，还受反应动力学、扩散控制与抗氧化剂消耗速率的显著影响。DPPH与ABTS法中，抗氧化剂反应动力学差异巨大——电子转移反应通常快速，而含空间位阻的酚类HAT反应较慢，固定终点检测可能系统性低估慢反应抗氧化剂；ORAC与自氧化类评价中，抗氧化剂的反应速率常数需超过被保护底物的氧化速率才能有效发挥链断裂作用，部分化合物可能因早期快速消耗表现为高反应速率常数但总AUC值中等。因此，抗氧化评价应结合动力学与终点测量，避免仅依赖单一指标。
   5.5 抗氧化评价方法的条件依赖性与混合机制本质
   传统将评价方法严格归类为HAT或SET的划分过于简化，多数方法在特定条件下可同时存在多种路径。例如DPPH与ABTS法的主导机制随溶剂组成与抗氧化剂电离状态改变，在乙醇中酚酸可能同时通过HAT、SET-PT与SPLET反应，而在水中FRAP活性更关联SPLET描述符。相比之下，ORAC/TRAP/HORAC因采用热生成的过氧自由基，更接近体内脂质氧化过程，被视为更一致的HAT主导型链断裂评价体系。因此，评价方法应被视为条件依赖的机制窗口，而非固有排他性体系。
   5.6 评价方法特异性偏倚、干扰因素与误读
   各评价方法均存在机制偏倚与基质干扰：ABTS/TEAC法的ABTS^•+为非生理性自由基，短终点易低估慢反应抗氧化剂；DPPH法的DPPH•为氮中心自由基，溶剂极性、pH与温度波动导致重现性差，且对空间位阻大的黄酮类反应不完全；FRAP法酸性条件(pH 3.6)可能抑制需部分去质子化的化合物活性，且易受还原糖、硫醇等非抗氧化还原剂干扰；CUPRAC法虽在近生理pH下进行，但仍属人工电子转移评价，不直接反映过氧自由基捕获效率；Folin-Ciocalteu法碱性条件(pH~10)下特异性差，糖类、氨基酸、亚硫酸盐等非酚类还原物质均可导致假阳性；ORAC法实验复杂度高，荧光探针、自由基引发剂浓度与动力学拟合模型均会影响结果。因此，需采用互补的正交评价方法并结合溶剂、pH与基质效应控制，才能获得可靠的抗氧化评价结果。
6. 6.
   结构-抗氧化活性关系
   不同评价方法对化合物结构的响应存在差异：ORAC/TRAP/HORAC类HAT主导方法适合含酸性质子、可稳定自由基的酚类与黄酮类化合物，低BDE值与共轭结构是活性关键；FRAP/CUPRAC类SET-PT主导方法适合缺乏酸性氢但易捐赠电子的化合物，杂环中的氧、氮、硫原子可提升体系极化率，促进电子转移；DPPH/ABTS作为双机制方法，可同时检测两类行为，但ABTS的空间位阻使其更偏向SET路径。溶剂极性通过稳定带电物种或中性中间体调控机制平衡，非极性溶剂利于HAT，极性溶剂促进SET-PT；pH通过影响抗氧化剂电离状态改变反应路径，酸性条件增强电子捐赠能力，碱性条件促进去质子化与自由基稳定。密度泛函理论(DFT)描述符可与实验结果整合：酚酸的DPPH活性与BDE、IP相关，FRAP活性与PA、ETE相关；黄酮类的ORAC活性需结合BDE与SPLET描述符才能准确预测，表明单一描述符无法通用，需结合评价方法机制选择。不同评价方法对同一化合物的活性排序可能存在差异，例如羟基苯甲酸与羟基肉桂酸在FRAP中没食子酸活性最高，在ORAC中迷迭香酸最强，而p-香豆酸在两方法中均较弱；黄酮类中二氢查尔酮与黄烷酮在DPPH中活性弱，但在ABTS与ORAC中响应良好，凸显机制导向选择的重要性。在植物提取物、食品等复杂基质中，多酚、维生素、蛋白质、还原糖等多组分共存会产生协同或拮抗作用，且基质成分会干扰吸光度检测，需结合电化学或色谱方法补充验证。
7. 7.
   抗氧化评价方法选择的系统化方法学
   为提升评价准确性，本文提出包含6个核心步骤的决策树框架：第一步根据样品类型与溶解度选择介质——亲水性抗氧化剂采用水性兼容体系，亲脂性抗氧化剂采用有机或胶束体系，复杂基质需结合电子转移与氢转移正交方法；第二步明确评价目标与预期机制——机制研究或还原力筛选选用电子转移/SPLET类方法，生理相关性过氧自由基链断裂评估选用ORAC/TRAP/HORAC类方法；第三步结合溶剂极性、pH与氧化还原环境——近中性水性体系利于SPLET，酸性体系利于直接电子转移，非极性环境利于HAT；第四步基于结构描述符与主导机制——低BDE值选HAT类方法，低IP与有利氧化还原电位选电子转移/SPLET类方法，结合pKa、logP等参数指导选择；第五步考虑基质复杂性与结果稳健性——简单纯化化合物可采用单一方法加正交验证，复杂基质需至少两种互补方法；第六步规范结果解读、交叉验证与报告——需明确说明溶剂、pH、反应时间、标准品与局限性，提升重现性与机制解释性。表2进一步总结了主要评价方法家族的机制基础、适用场景、选择要点与分析局限，强调无单一方法可全面覆盖所有化合物与基质，互补正交评价是可靠表征的核心。
8. 8.
   结论
   抗氧化活性的精准评估是识别具治疗潜力生物活性化合物的关键。抗氧化剂通过HAT、SET-PT或SPLET机制清除ROS，而评价方法也具有机制特异性，方法-机制不匹配将导致假阴性或结果高估。本文提出的机制导向系统化选择框架，整合了热力学描述符、动力学效应、基质影响与结构-活性关系，超越了传统描述性方法罗列，为抗氧化评价提供了更具操作性的理论依据。该框架有助于提升评价结果的可靠性、重现性与可解释性，减少方法学不一致性，促进研究间有意义的比较，加速抗氧化候选物的筛选与转化应用。