《Results in Engineering》：Comparative Study of Extrusion Printing Methods and Geometric Parameters for Tubular Printability of Alginate-Based Hydrogels
中空器官或管状工程组织代表了组织工程与再生医学领域的创新性进展。尽管基于挤出的生物打印技术在制造此类结构方面具有多样性优势，但获得几何稳定且高纵横比的管状结构仍具挑战性。本研究中，研究人员对海藻酸盐基水凝胶生物墨水进行了系统性研究，重点关注2%及3% w/v海藻酸盐配方。研究考察了单一改性剂（卡拉胶，Carrageenan）以及不同交联方法和打印配置（冷板与 coaxial 系统）的影响。共对六种配方进行了比较评估，评估指标包括几何保真度、可实现的管状高度及壁厚均匀性。在海藻酸盐基配方优化后，进一步研究了几何参数在管状成型性中的作用，尽管该方面在早期研究中较少受到关注。优化后的配方组成为2% w/v海藻酸盐与1.5% w/v卡拉胶，以8:1比例预交联1% w/v CaCl?，该配方支持在三种不同长径比（L/D）条件下制造直径为5-9 mm的管状结构。直径为9 mm的管状结构可在长径比达2.5的条件下打印成型。这些结果为未来管状生物打印策略的比较与优化提供了有益基础。
管状组织工程旨在设计和制造模拟体内管状器官或组件自然形态与功能的人工结构，如血管系统、消化系统及呼吸系统。此类结构在组织工程中既适用于微观尺度也适用于宏观尺度。微观管状结构常模拟血管、毛细血管及神经组织的微架构，而宏观管状结构则为肉眼可见的较大管状构型，包括血管、气管或输尿管等。血管是管状结构的典型代表，其直径范围跨越微观至宏观尺度，动脉直径约25 mm，负责将富含氧气和营养的血液从心脏输送至全身，并进一步分支为直径10-0.1 mm的小动脉；毛细血管直径为5-10 μm，实现血液与周围组织间的物质交换。不同类型的管状结构服务于特定应用，其制造方法因尺寸和材料而异。
在组织工程中，管状结构常采用合成或天然水凝胶作为生物墨水进行制造，这得益于水凝胶的高含水量和优异的生物相容性，能够很好地模拟天然细胞外基质以促进管状组织再生。合成水凝胶通过化学合成制备，可精确调控其物理化学特性，包括机械强度、降解速率等多种性质，常见的有聚乙二醇（poly(ethylene glycol), PEG）水凝胶、Pluronic F-127等。天然水凝胶来源于生物材料，常更接近天然组织中的细胞外基质，可提供具有增强生物相容性和组织再生能力的细胞支持环境，典型材料包括胶原蛋白、壳聚糖、明胶、海藻酸盐（sodium alginate, SA）、透明质酸和纤维蛋白及其混合物。其中，海藻酸盐基水凝胶因其生物安全性、在生理环境中的可控凝胶化能力以及易于成型等特点，广泛应用于细胞包封。
三维（3D）打印因其能够制造具有可控几何形状的复杂结构而被广泛应用于管状结构的制造。在生物医学领域，生物打印是一种特殊的3D打印形式，其使用含有细胞和生物材料的生物墨水制造具有生物学功能的结构体。主要生物打印技术包括喷墨式、立体光刻、激光辅助和基于挤出的技术，各具特点。前三种技术提供高分辨率和优异的结构保真度，但通常成本较高、系统复杂（如激光源或液滴系统），且存在材料限制，如需要低粘度生物墨水或与光诱导加工相容的光敏材料。相比之下，基于挤出的生物打印更适合中至高粘度水凝胶，能够实现稳定的丝条成型和连续沉积，两者对于制造管状结构至关重要。此外，该技术能够处理含细胞水凝胶、高效制造三维结构且操作相对简单，因此在本研究中被选用。
基于挤出的生物打印制造管状结构主要有四种方法：牺牲法、嵌入法、 coaxial 法和常规挤出生物打印。牺牲法和嵌入法可实现更复杂的几何形状，但需要额外材料和后处理步骤，增加了整体制造复杂性。 coaxial 生物打印通过双流挤出可直接制造中空管状结构，但需要更精确的流量控制和参数优化，尤其对于较大几何结构。在这些方法中，常规挤出生物打印是一种更简单、更具成本效益的方法，具有打印头设计简洁、处理步骤少、材料兼容性广等优点。
凝胶化是水凝胶从液态转变为凝胶网络的过程，可通过物理交联和化学交联实现。物理交联利用非共价相互作用形成水凝胶网络结构，离子交联是标准的物理交联技术，依赖于带电分子间的静电相互作用，例如海藻酸盐基水凝胶可在二价阳离子如钙离子作用下发生凝胶化。热交联利用温度变化诱导凝胶形成，如明胶水凝胶在高温下溶于溶剂，低温时因聚合物相互作用增强而形成凝胶。化学交联通过聚合物链间形成共价键构建网络结构，通常通过添加交联剂或引发反应来形成稳定的共价键，如明胶可用戊二醛通过与氨基的共价交联进行化学交联，紫外线（UV）可引发含光引发剂的水凝胶前体溶液聚合，形成化学交联网络。
每种凝胶化方法各有优劣，取决于水凝胶材料、所需凝胶化速度、结构完整性以及与包封细胞或生物活性分子的相容性。UV交联法的主要优势在于快速固化和极少产热，可获得高质量的生物打印结构，但自由基和光引发剂已被证明会影响细胞相容性和细胞增殖，且成本常被视为该方法的缺点。相比之下，海藻酸钙离子交联因其低成本和相对简单而被广泛研究，但所得水凝胶常表现出有限的形状保真度和较差的结构稳定性，主要由于钙离子分布不均匀以及离子相互作用本身弱于共价键，导致其机械性能在多数情况下低于UV诱导的共价交联系统。尽管存在这些局限，基于Ca2?的交联策略仍被广泛研究以改善这一经济简便方法的打印性能和交联效果。
水凝胶的流变行为，尤其是海藻酸盐基生物墨水，是影响其打印性能和打印结构质量的关键因素。在挤出生物打印过程中，材料应兼具足够的流动性以通过喷嘴，同时保持足够的粘弹性稳定性以维持沉积后的形状。粘度过高或凝胶化过强的生物墨水可能导致挤出不稳定和喷嘴堵塞，而凝胶状行为不足则会导致丝条铺展和结构保真度差。这些流变特性受多种因素影响，包括聚合物浓度、交联程度、分子间相互作用和打印温度。
预交联是促进水凝胶内部部分网络形成的有效方法，可在打印前实现从液态到粘弹性凝胶态的转变。在较低程度的预交联过程中，Ca2?离子可能与海藻酸盐链建立足够的离子相互作用以增强粘度并诱导凝胶状行为，同时不会过度损害流动性。这导致更受控的挤出流动，材料在施加应力时变形但沉积后保持足够的结构完整性，从而改善丝条连续性和形状保真度。对于钙基离子交联剂，交联剂的类型和用量均显著影响海藻酸盐基水凝胶的流变行为和打印性能。研究表明，海藻酸盐分子量、交联剂和预交联比例强烈影响挤出行为和丝条铺展，其中CaCl?在最佳比例下表现出最低的铺展比，但需要较高的挤出压力。
除预交联方法外，添加流变改性剂如黄原胶、纳米纤维素和卡拉胶也已被广泛探索，以增强低浓度海藻酸盐基水凝胶的流变行为和打印性能。这些流变改性剂来源于天然材料，据报道具有生物相容性，适用于海藻酸盐基生物墨水。黄原胶增强挤出稳定性但提供的结构支撑有限；纳米纤维素通过纤维网络改善形状保真度，但对浓度高度敏感，会导致屈服应力和挤出阻力快速增加。卡拉胶是最早且最广泛使用的天然多糖之一，以其生物相容性、生物可降解性和安全性而著称，且因提取工艺简单而比纳米纤维素相对便宜。此外，卡拉胶提供更平衡的流变改性效果，在提高粘度和剪切变稀性的同时保持良好的可挤出性和适度的结构支撑。
打印后的后交联用于进一步增强网络，从而提高机械性能并稳定水凝胶结构。对于海藻酸盐基水凝胶，打印后的样品通常浸入1-2% w/v的交联剂溶液中一段时间以实现通过离子凝胶化的后交联。对于含明胶的水凝胶，常用戊二醛溶液作为化学交联剂，而UV基系统则采用光照射引发打印后交联。
尽管管状结构的几何形状相对简单，但实现期望的高度仍是一个重大挑战。下层往往缺乏足够的刚度来支撑上层，随着结构高度增加而影响结构质量。多项研究已探究了各种生物打印和交联策略以增强管状水凝胶结构的制造，但这些研究大多较为零散且缺乏系统比较。已有研究使用悬浮浴法制造了直径5-12 mm的管状结构，但更高结构未予报告；也有研究采用支持浴法制造直管或倾斜管，但该技术的固有限制包括多打印头集成受限、制备复杂性增加以及支持材料去除困难等。另有研究利用UV光交联的甲基丙烯酸明胶生物墨水制造了L/D比达2.5的明确定义管状结构，但光引发剂需求、较高成本以及生物相容性和材料兼容性限制仍是光基生物打印方法的关键缺陷。虽有研究使用黄原胶作为改性剂，但仅报告了特定尺寸的管状结构。其他研究采用旋转聚乙烯醇棒作为牺牲模板创建延长长度的血管管，但所得几何形状不均匀；或开发了 coaxial 打印头制造具有低L/D比的中空结构和微通道，但管和网格结构的形状稳定性有限。尽管网格结构的打印性能已被广泛研究，管状结构的打印性能仍然有限。总体而言，非UV交联方法虽然简单经济，但在使用常规挤出生物打印制造管状结构方面仍面临局限，大多数研究聚焦于大直径（>10 mm）且高度超过L/D比1-1.5的管。此外，尽管L/D比和直径等关键设计参数对结构稳定性至关重要，但管状几何形状本身及这些参数受到的关注相对较少。因此，开发优化或混合交联策略对于获得适用于更广泛组织工程应用的机械稳定、结构一致的管状水凝胶仍然至关重要。
本研究对海藻酸盐基挤出打印管状结构进行了比较评估，考虑了六种材料配方、卡拉胶作为单一改性剂的添加，以及在一致条件下的各种交联策略。采用关键几何参数包括管状可打印高度和顶层壁厚均匀性来评估不同打印策略的打印性能。基于该比较，确定了最佳打印策略，并随后用于深入评估以往研究未充分探讨的管状几何形状的打印性能。此外，本研究系统研究了管直径和L/D比对形状保真度的影响，这也是以往研究不足之处。该工作旨在为基于挤出的生物打印中管状结构的更可靠评估和制造提供支持。
研究人员使用模块化多打印头生物打印系统Bio3DP-V2开展实验，该系统采用螺距为1 mm的丝杠机构驱动X、Y、Z轴，理论定位分辨率为5 μm（未使用微步进），通过微步进可进一步提高。系统配备两个可互换打印头安装位，本研究使用了三种打印头并安装在系统的辅助和次要安装位上。气压驱动挤出打印头基于气压驱动挤出生物打印，配备集成加热单元和温度传感器以实现打印温度的精确控制。 coaxial 挤出打印头衍生自气压驱动打印头，采用 coaxial 喷嘴配置，两个同心针实现两种不同材料的同时挤出，海藻酸盐溶液通过内针输送，CaCl?溶液通过外针输送。为实现打印过程中的热电冷却，将冷台模块集成到打印平台，铝制打印板作为冷侧，热侧与水冷散热器耦合。系统通过循环水流经散热器散发热电（Peltier）模块产生的热量，四个热电模块以2×2紧凑排列实现铝板上温度均匀分布，可使平台温度降至0°C。
研究人员设计了不同直径D和高度L、壁厚0.4 mm的管状结构，使用9 mm直径、最大20 mm高度的管状结构评估不同配方在打印过程中的打印性能，并使用更广泛的直径范围（5、6、7、8、9 mm）和L/D比（1、1.5、2）评估最优配方的打印性能。为评估各种方法和材料的打印性能，使用Cura软件生成具有单周向打印线的部件。
实验材料包括海藻酸钠（sodium alginate, SA）、氯化钙（CaCl?）颗粒、食品级卡拉胶粉末和A型明胶。制备了2%和3% w/v的海藻酸钠溶液、12% w/v的明胶溶液以及1%和2% w/v的氯化钙溶液。海藻酸钠基体系包括通过预冷工艺制备的3SA-12GL预冷凝胶，以及通过预交联工艺制备的3SA预交联、2SA预交联和2SA-1.5Carr预交联水凝胶。选择1% w/v CaCl?与海藻酸钠基溶液以1:8的体积比以实现约10 mM的最终CaCl?浓度。预交联溶液制备的关键注意事项为：使用连接器连接两个注射器，混合时先将CaCl?溶液注入海藻酸钠注射器，然后立即反向流转将海藻酸钠溶液转回CaCl?注射器，初始混合过程快速进行以确保均匀混合并防止界面处不均匀凝胶化，这种往复转移用于最小化过早局部交联。
实验采用开发的Bio3DP-V2三维生物打印机进行，尺寸偏差对于聚己内酯约为10 μm/mm，对于海藻酸钠基水凝胶约为30 μm/mm。主要使用气压驱动挤出打印头进行水凝胶挤出，并准备了包括用于海藻酸钠芯打印的 coaxial 挤出打印头和用于CaCl?外壳打印的活塞驱动挤出打印头的定制 coaxial 系统。25G中等规格针头用于常规挤出打印， coaxial 打印过程中使用23G长针进行芯打印、17G短针进行外壳打印。所有样品的打印速度保持1 mm/s。
在流变学性能表征方面，使用配备平行板几何结构的MCR 102e流变仪在25°C下对除3SA-12phasor(CP)在37°C外的所有配方进行稳态剪切下的粘度测量，剪切速率范围为0.1-1000 s
-1。使用幂律模型进一步分析水凝胶配方的流动行为：η=Kγ
?n-1，其中η为粘度，γ
?为剪切速率，K为稠度指数，n为流动行为指数。较低的n值表示更强的剪切变稀行为。
为评估不同打印条件下海藻酸盐基生物墨水的管状打印性能，测量了关键几何保真度参数包括高度保真度和顶层壁厚均匀性，以量化打印管与预期设计的匹配程度。高度保真度通过卡尺测量打印管高度并与设计高度比较，每个条件测试三次，最大可实现高度定义为结构坍塌前的高度。顶层壁厚均匀性从顶视图通过测量单条打印路径圆周上九个均匀分布点的丝条壁厚来评估，使用Image Focus Plus V2软件进行图像分析。
使用优化的打印条件（2SA-1.5Carr预交联）评估管状几何对打印性能的影响，包括直径5-9 mm和三种L/D比（1、1.5、2）对形状保真度、壁厚和收缩倾向的影响。形状保真度以锥度比或直径偏差表示，定义为结构高度方向直径的相对变化，以顶部与底部直径之差除以底部直径计算。打印后，结构浸入1% w/v CaCl?溶液约10分钟以完成后交联，然后轻轻吸干去除多余溶液进行测量。
结果表明，所有配方均表现出非牛顿剪切变稀行为，有利于挤出打印。3SA-12GL预冷体系在大部分剪切速率范围内粘度最高，尤其低剪切速率下表现出高抗流动行为；而2SA和3SA-12GL冷板体系粘度明显较低，易于挤出但沉积后结构稳定性较弱。预交联配方表现出中高粘度和明显的剪切变稀行为，在流动性和打印后形状保持之间取得平衡。幂律拟合确认了这些流变学差异，所有样品的流动行为指数n均小于1，证实假塑性行为。预交联体系表现出适中的n值（0.104-0.167）和较高的K值（186.55-323.59 Pa·s），反映强剪切变稀行为和挤出后改善的结构完整性。2SA-1.5Carr预交联表现出平衡的流变行为，n值为0.1466，K值为236.1 Pa·s。
在打印策略对打印性能的影响方面，不同方法产生了打印质量、稳定性和可打印高度的明显差异。3SA-12GL冷板体系中，底部不透明白色凝胶区域与顶部透明非凝胶区域之间存在明显分离，表明沿高度方向交联不完全，最大可打印高度约4 mm，归因于冷平台冷却效果向高层传递有限。3SA-12GL预冷体系稳定性略有改善，但环境波动导致打印条件不一致。2SA-1Ca coaxial 体系中CaCl?泄漏随打印时间逐渐在底部积累，导致局部过度交联和在约13 mm处坍塌，不均匀表面形态表明沿结构交联不均匀。预交联体系中，3SA预交联达到约14 mm，但上层出现颈缩点阻止高度进一步增加；2SA预交联达到约13 mm且一致性较好，但较高处倾向于倾斜，表明上层自支撑能力有限。最佳结果为2SA-1.5Carr预交联，稳定达到约20 mm高度，无可见颈缩且直度最高。
壁厚均匀性方面，所有样品均出现模糊区域，仅2SA-1.5Carr预交联除外，模糊程度各异，3SA-12GL预冷和3SA预交联最为明显。3SA-12GL冷板打印的初始打印层展现出清晰明确的线条和平滑表面，表明在0.25 bar低打印压力下快速有效交联，顶部因凝胶与非凝胶层分离出现小模糊区域。3SA-12GL预冷样品表面粗糙，反映预冷后材料不均匀性，打印路径不清晰且边缘模糊。2SA-1Ca coaxial 样品壁厚均匀性最低，表面质量因打印过程中交联过程不稳定而降低。尽管施加较高压力，3SA预交联材料表现出不稳定挤出行为，导致边缘形态模糊。2SA预交联样品更透明均匀，壁厚高于含卡拉胶配方，可能因为材料挤出时流动性更好。2SA-1.5Carr预交联即使在20 mm高度，边缘仍保持清晰、表面平滑，表明材料流动高度稳定且高度保真度强，壁厚也最为均匀。
在管状几何对打印性能的影响方面，锥度比随管径增大而降低，表明较大直径处尺寸稳定性改善。L/D=1时，锥度比从5 mm约6.5%降至9 mm以下1%。L/D增至1.5时，锥度比显著上升，5 mm为18%至9 mm为4%。L/D=2时类似，5 mm达最大约19%，9 mm逐渐降至约5%。打印样品的圆度在不同L/D比下变化不大，表明打印行为稳定。较高L/D比时壁厚略有增加，壁厚随直径从5增至7 mm轻微下降（10-15%），较大直径处基本恒定。L/D比的影响为次要因素，L/D=2比L/D=1.5 consistently高0.05-0.1 mm。
后交联后，管状结构从透明变为不透明白色，表明外周和内部均形成交联网。后交联管变得更强更有弹性，易于操作移动，但高度和直径均显著收缩，平均分别约15%和10%。5 mm结构在L/D=2时倾向于堵塞，使其不太适合常规挤出打印。对于9 mm管状结构，L/D比可达2.5，最后两层观察到轻微直径减小，表明层-by-层沉积过程中上部区域轻微结构松弛和支撑减少。
讨论部分指出，虽有多项研究调查了网格结构的打印性能，但系统性研究管状架构的仍有限，且以往工作主要基于材料组成比较打印性能，对不同交联策略影响的关注相对较少。本研究聚焦于管状结构的打印性能，特别强调了交联方法和材料组成的影响。所研究水凝胶的打印性能由流变学特性、多层沉积过程中的结构恢复与几何约束之间的关系共同决定，而非仅由剪切变稀行为决定。低稠度指数（K）和高流动指数（n）的配方因流动阻力降低而更易于挤出，但其弱结构恢复限制了在无外部支撑下维持管状几何的能力。温度敏感网络如明胶-海藻酸钠体系减少了打印稳定性，表明过度的初始网络形成与网络形成不足同样不利。尽管打印过程在名义室温25°C下进行，环境条件波动仍可能影响打印稳定性和可重复性，因此完全温控的腔室和打印头精确冷却温度调节对确保更稳定的打印条件是必要的，这代表了当前打印系统的局限。
相反，预交联配方因较高的K值和较低的n值表明更强的剪切变稀行为和挤出后更好的结构恢复而展现出改善的管状稳定性。海藻酸盐由β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）组成，G富集区段主要通过与Ca2?离子的相互作用负责离子凝胶形成，导致机械稳定网络结构的形成。较高海藻酸盐浓度增强链缠结和网络强度，但增加粘度也需要更高挤出压力。所有配方中，结合部分Ca2?预交联和卡拉胶的混合体系在2% w/v海藻酸盐溶液中表现出最平衡的性能，高度保真度达60层，可实现L/D比2.5。尽管结构稳定性仍低于L/D比3的UV基方法，但本方法性能优于其他改性剂体系或卡拉胶10层矩形中空形状，即使在降低Ca2?浓度导致较低打印压力的条件下。这种行为可能与适度预交联程度有关，其中部分且均匀分布的Ca2?介导的海藻酸盐链间相互作用增加了粘度并促进凝胶特性，同时仍保持足够流动性。此外，卡拉胶提供促进链缠结和改善粘弹性稳定性的二级物理网络 ,从而增强沉积后丝条连续性和形状保持。双网络的联合效应以及Ca2?介导的氢键和离子相互作用等分子间相互作用，有助于形成更稳定、更凝聚的凝胶结构。关键点还可能与基于注射器连接器的预交联方法有关，该方法提供更均匀的混合和减少的制备时间， resulting in 更均匀的交联网络分布和挤出过程中更稳定的材料流动。总体而言，当在不过度损害挤出稳定性的前提下实现足够的结构恢复时，达到最佳管状打印性能。
关于管状几何参数如何影响打印性能的系统性研究在文献中仍有限。本研究结果证明管状结构的打印性能强烈受几何约束，直径和L/D比均在沉积过程中变形行为中起关键作用。对于2SA-1.5Carr预交联水凝胶，在5-9 mm直径范围内实现了稳定打印，较大直径处因曲率效应减小和应力分布更均匀而形状保持更好。较小直径处，打印路径的较高曲率促进挤出丝条向内收缩，导致更大几何偏差和更明显锥度千克穿增穿穿穿穿穿穿穿穿穿穿穿。增增大四射穿穿穿穿穿穿穿穿穿穿穿穿
