电子鼻结合HS-SPME/GC-MS技术对不同发育阶段经外源2,4-表油菜素内酯及其抑制剂芸苔素唑处理的辣椒果实挥发性物质进行表征

《Scientia Horticulturae》：Electronic nose combined with HS-SPME/GC-MS for characterization of volatile substances in pepper fruits treated with exogenous 2,4-epibrassinolide and its inhibitor brassinazole across different developmental stages

　　

香气品质是决定辣椒（Capsicum annuum L.）市场价值的关键因素。本研究采用便携式电子鼻（PEN3）和顶空固相微萃取/气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）技术，综合评估了不同浓度24-表油菜素内酯（EBR，0.05–1.0 mg/L）及其特异性生物合成抑制剂芸苔素唑（BRZ，0.5–2.0 mg/L）对辣椒果实挥发性化合物的影响。通过多元统计分析和气味活性值（OAV）计算鉴定差异代谢物。结果表明，挥发性物质积累高峰出现在绿熟期（36 DPA）。低浓度EBR（0.05–0.1 mg/L）处理显著增加了氮氧化物、芳香物质和硫化物的积累，提高了总挥发性物质含量，并使醛类（增加25.5%）和醇类（增加24.8%）化合物含量上升。相反，B3处理（1.5 mg/L）导致总挥发性物质降低19.8%。在99种已鉴定化合物中，14种的气味活性值（OAV）大于1，其中E1处理（0.05 mg/L）表现出最高的总OAV值。此外，VIP分析鉴定出15种差异挥发性物质作为与EBR/BRZ处理相关的特征生物标志物。综上所述，外源施用低浓度EBR（0.05–0.1 mg/L）可促进醛类（如己醛）、醇类（如(2Z)-2-己烯-1-醇、叶醇）和含氮杂环化合物（如2-异丁基-3-甲氧基吡嗪）等物质的积累，从而显著改善辣椒果实的芳香品质。这些发现为通过油菜素内酯（BR）介导提升辣椒果实风味提供了理论基础。

辣椒（Capsicum annuum L.）作为茄科代表性物种，兼具经济价值与生物多样性优势，在全球饮食文化中占据重要地位。辣椒的独特风味由数百种挥发性芳香化合物与非挥发性味觉成分协同作用形成，这一复杂特征已成为食品化学、植物代谢工程及感官科学领域的研究热点。香气作为辣椒果实的核心感官属性，由挥发性有机化合物（VOCs）的复杂组合所决定。研究表明，辣椒中香气物质的多样性远超常见果蔬，已鉴定出超过300种与辣椒风味相关的化合物，主要包括萜烯类、醛类、酮类、酯类和含硫化合物等。其中，萜烯类化合物（如β-紫罗兰酮、芳樟醇、柠檬烯）是构成辣椒果香与花香特征的主要贡献者，其生物合成依赖于质体中的甲基赤藓糖醇磷酸（MEP）途径或细胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径，并由萜烯合成酶（TPS）催化。醛类（如己醛、反式-2-己烯醛）则通过脂氧合酶（LOX）途径由亚油酸和α-亚麻酸衍生而来，赋予辣椒青香与清新感；而含硫化合物（如甲硫醇、3-甲基丙醛）与辣椒特有的刺激性气味密切相关。值得注意的是，辣椒香气特征具有显著的品种特异性和发育动态性：甜椒因酯类含量高而呈现温和果香，哈瓦那辣椒则因富含挥发性酯类、萜烯类等而展现浓郁果香与异域风味。在果实成熟过程中，香气物质发生显著转化，未成熟绿椒的典型青香、辛香与草香相关化合物如己醛和2-异丁基-3-甲氧基吡嗪随成熟逐渐降低，而呈现果香、花香和甜香的脂肪酸酯类、萜烯类等在后期显著积累。

油菜素内酯（BR）被视为第六大类植物激素，促进植物多种代谢物的形成。24-表油菜素内酯（EBR）作为BR的合成类似物，表现出更高的稳定性和更广泛的生物活性谱。芸苔素唑（BRZ）作为三唑类合成抑制剂，可阻断BR合成 late C6途径中CNs向6dCT和6-脱氧CT的羟基化，以及早期C6途径中6-氧代茶酚（6-oxoCN）向CT和CT向TE的转化。已有研究发现，EBR处理可促进葡萄、番茄等果实中香气物质的积累，但关于BR对辣椒挥发性物质影响的研究仍十分有限。

基于此研究背景，研究人员以中国甘肃省白银市靖远县东湾镇大棚栽培的'华美105'辣椒为实验材料，该品种具有植株生长健壮、果实发育快、低温坐果能力强等特性。实验设置九组处理：对照（CK，0 mg/L）、E1（0.05 mg/L EBR）、E2（0.1 mg/L EBR）、E3（0.5 mg/L EBR）、E4（1.0 mg/L EBR）、B1（0.5 mg/L BRZ）、B2（1.0 mg/L BRZ）、B3（1.5 mg/L BRZ）和B4（2.0 mg/L BRZ），于花后10天开始，每隔5天喷施一次，共5次，分别于3、9、15、21、28天进行，在24天（果实膨大期，24 DPA）、36天（绿熟期，36 DPA）、48天（转色期，48 DPA）和60天（60 DPA）取样。研究中采用的关键技术方法包括：便携式电子鼻（PEN3）技术，该设备配备10个化学传感元件，通过检测挥发性物质与纯空气的电导率比值（G/G₀）进行响应分析；顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME/GC-MS）技术，采用DB-Wax毛细管柱进行分离，以高纯氦气为载气，结合自动解卷积系统（AMDIS）和NIST 2014质谱库进行化合物鉴定，采用内标法（2-辛醇，8.19 mg·L^-1）进行定量；通过计算气味活性值（OAV）确定关键致香成分；并运用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）及变量重要性投影（VIP）评分等多元统计方法进行数据分析。

电子鼻分析结果方面，雷达图显示不同浓度EBR和BRZ处理对辣椒果实挥发性香气物质的影响具有时间依赖性和组间差异性。E处理在36 DPA至48 DPA期间表现出显著优势，而B处理呈现较为平缓的响应特征。不同成熟阶段处理间的差异主要集中在W1C、W5S、W3C和W2W传感器，其中W5S传感器的相对电导率（G/G₀）值最高。随着果实成熟，W5S和W2W呈先升后降趋势，在绿熟期（36 DPA）和转色期（48 DPA）的G/G₀比值最高。在十个传感器中，辣椒挥发性物质随EBR浓度升高而逐渐降低，而高浓度BRZ处理显著减少挥发性物质的积累。36 DPA时，W5S和W2W在E1处理下达到峰值，其次为E2处理；B3处理下G/G₀比值最低。48 DPA时，E1处理的W5S值急剧下降，较峰值降低53.8%。60 DPA时进一步回落至7.64，接近CK水平，表明E处理的刺激作用具有时间敏感性。聚类热图分析显示，处理样品间挥发性香气物质的差异主要集中在36 DPA至48 DPA范围，处理效果呈现"激活-峰值-衰减"的三阶段特征，E1和E2处理表现出明显的处理优势，对芳香族化合物、氮氧化物和有机硫化物含量响应值高；而B3和B4处理效果较差。

HS-SPME/GC-MS检测结果方面，在36至48 DPA期间共检测到99种挥发性代谢物，分属11个类别，包括9种醇类、8种醛类、7种酮类、16种酯类、3种酸类、9种烷烃、13种烯烃、17种芳香烃、2种炔烃、2种醚类和13种杂环化合物。从物质比例看，醛类占比最大（25.1%），其次为醇类（24.7%）、烯烃（15.1%）、烷烃（12.3%）、杂环化合物（9.0%）、芳香族化合物（6.3%）、酯类（4.1%）等。随着果实成熟，总挥发性香气物质（TVAS）逐渐降低，在36 DPA时E1处理下达到峰值，比CK高11.9%，差异主要集中在醇类、醛类和芳香烃，分别比CK高8.9%、7.2%和44.9%。E2处理总含量略低于E1，但酯类和烯烃释放量最高，分别比CK高18.7%和14.2%。B处理中，B3和B4的TVAS分别为2297.41 μg·kg^-1和2325.39 μg·kg^-1，比CK分别降低19.8%和18.8%；B3处理的核心物质醛类和酯类较CK分别降低29.8%和56.7%。48 DPA时，TVAS普遍下降，E1降至1760.75 μg·kg^-1（降低49.1%），主要挥发性物质醇类、醛类和芳香烃较36 DPA分别降低34.8%、40.2%和69.1%。

Pearson相关分析表明，W5S和W2W与醇类（r ≥ 0.96，p < 0.01）、醛类（r ≥ 0.93，p < 0.01）、酯类（r ≥ 0.93，p < 0.01）、烷烃（r ≥ 0.92，p < 0.01）、烯烃（r ≥ 0.89，p < 0.01）、芳香烃（r ≥ 0.89，p < 0.01）和杂环化合物（r ≥ 0.95，p < 0.01）具有显著正相关，是与鉴定物质相关性最强的传感器。

OAV分析结果显示，共14种特征气味成分的OAV > 1。其中，2-异丁基-3-甲氧基吡嗪在不同处理下均表现出较高的OAV值，对辣椒整体气味特征贡献显著；β-紫罗兰酮和4-甲基-4-戊烯酸乙酯也具有较高的OAV值，赋予辣椒果实果香、木香和清新风味。己醛在E1处理36 DPA时OAV值最高（169.15），显著高于CK。从E1处理总OAV最高，达104010.83，表现出显著处理优势。

多元统计与计量分析方面，基于84种挥发性有机化合物的PCA分析显示，不同处理样品在第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）上分别解释了45.9%和22.7%的总变异，累积贡献率为68.6%。PLS-DA分析构建的模型具有优异的拟合度（R²=0.97）和预测能力（Q²=0.93），样品被分为E处理、B处理和CK三大组群。VIP分析筛选出15种关键挥发性代谢物作为生物标志物，包括C₆醇-醛化合物（己醛、(2Z)-2-己烯-1-醇、(3E)-3-己烯-1-醇、叶醇、反式-2-己烯-1-醇）、含氮杂环化合物（2-异丁基-3-甲氧基吡嗪）、苯丙素类/芳香族化合物（水杨酸甲酯、1,2-二甲基-4-乙基苯）以及脂肪酸衍生的烃类和酯类化合物。这些特征代谢物模式可有效区分不同处理。OPLS-DA分析进一步表明，CK与各处理均显著分离，E1和E2处理上调了更多化合物含量，而B3和B4处理则下调更多。E1处理上调了叶醇、(2Z)-2-己烯-1-醇、己醛和2-异丁基-3-甲氧基吡嗪等7种代谢物；E2处理上调了叶醇、甲苯、顺式-3-己烯基异丁酸酯、3,3-二甲基-1-戊烯和3,4-癸二烯等5种代谢物。相比之下，B3处理降低了10种代谢物，B4处理下调了11种代谢物。

讨论部分，研究人员指出电子鼻可利用电化学传感器将气味信息转化为气味指纹图谱，实现香气特征的快速一致评估。辣椒主要挥发性成分包括氮氧化物、芳香族化合物和有机硫化物，这与前人研究结果一致。不同发育阶段表现出显著的时间特异性，主要集中在绿熟期（36 DPA）和转色期（48 DPA）。从发育阶段看，绿熟期各种化合物的含量和丰度显著高于转色期，这可能反映了代谢资源的重新分配，如C₆醛类物质在成熟过程中可能转化为其他代谢物，代谢物质可能向与成熟相关的进程重新分配。从物质比例看，醛类、醇类和烯烃占比最大，前人研究已证实醛类和酯类是辣椒果实的主要挥发性物质，研究人员推测这一机制可能归因于脂氧合酶（LOX）途径的激活。在植物中，C₆醛和醇主要通过亚油酸和α-亚麻酸经LOX、氢过氧化物裂解酶（HPL）和醇脱氢酶（ADH）的酶促级联反应合成。研究表明，BR可增加9-LOX和ADH基因的表达，EBR诱导的醛类和醇类水平增加可能由LOX途径的转录上调介导。

研究结论表明，外源24-表油菜素内酯（EBR）可显著调控采后辣椒果实的挥发性香气特征，其效应表现出浓度依赖性和时间敏感性。电子鼻（PEN3）结果表明，处理间差异主要集中在36 DPA至48 DPA范围；E1（0.05 mg/L）和E2（0.1 mg/L）处理对芳香族化合物、氮氧化物和有机硫化物含量有显著影响。HS-SPME/GC-MS共鉴定出99种挥发性代谢物，其中14种化合物（OAV>1）驱动辣椒果实香气，特别是己醛和2-异丁基-3-甲氧基吡嗪是构成青草香、辛香和果香的主要贡献者。E1处理使总挥发性物质（TVAS）最大化，较CK高11.9%，差异主要集中于醇类、醛类和芳香烃。多元统计（OPLS-DA/VIP）进一步筛选出15种生物标志物代谢物（如己醛、2-异丁基-3-甲氧基吡嗪、(2Z)-2-己烯-1-醇、(3E)-3-己烯-1-醇等），有效区分了不同处理，并作为标记物使EBR处理影响辣椒果实的风味品质。这些发现为辣椒风味特征分析和目标品质改良提供了理论基础。