《Journal of Biological Chemistry》：1-Deoxysphingolipids Require Very-Long-Chain Ceramide Synthesis to Induce ER Stress and Cytotoxicity
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摘要：鞘脂(Sphingolipids)作为膜组分及信号分子在细胞系统中发挥关键作用。其从头生物合成发生于内质网(ER, endoplasmic reticulum)，起始于氨基酸（通常为丝氨酸Serine）与脂肪酰辅酶A的缩合反应。在特定病理条件下，丙氨酸可
摘要：鞘脂(Sphingolipids)作为膜组分及信号分子在细胞系统中发挥关键作用。其从头生物合成发生于内质网(ER, endoplasmic reticulum)，起始于氨基酸（通常为丝氨酸Serine）与脂肪酰辅酶A的缩合反应。在特定病理条件下，丙氨酸可替代丝氨酸参与缩合反应，生成缺乏鞘氨醇碱基C1位羟基的1-脱氧鞘脂(1-deoxysphingolipids)。与典型鞘脂不同，1-脱氧鞘脂无法接受亲水头基修饰，使其代谢加工改变且不能经经典途径降解。此类"无头(headless)"1-脱氧鞘脂的蓄积可导致多种神经及代谢性疾病中的神经毒性。本研究通过全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定SH-SY5Y细胞（用于研究神经毒性反应的模型）中1-脱氧鞘氨醇(1-deoxysphinganine)诱导毒性所需的通路，首要基因 hits 指向合成含超长链脂肪酸(C22–C26)神经酰胺(Ceramide, 含超长链脂肪酸VLCFA, very-long-chain fatty acid)的通路。研究人员利用CRISPR-Cas9构建TECR或CERS2基因功能缺失(loss-of-function, LOF)突变的SH-SY5Y细胞（二者均为超长链神经酰胺合成关键基因），验证该通路是1-脱氧鞘氨醇介导毒性所必需。此外，研究人员证实神经酰胺合成通路是1-脱氧鞘氨醇触发ER应激所必需的——野生型(WT)细胞经1-脱氧鞘氨醇处理后未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)显著上调，而TECR或CERS2 LOF突变SH-SY5Y细胞则无此现象。综上，数据支持如下模型：1-脱氧鞘氨醇经神经酰胺合酶(ceramide synthase, CERS)依赖的方式转化为超长链1-脱氧神经酰胺(very-long-chain 1-deoxyceramide)物种，是充分诱导ER应激与细胞毒性所必需的。本研究揭示了1-脱氧鞘脂蓄积所致神经病理性疾病的潜在治疗靶点。
论文解读：1-脱氧鞘脂(1-Deoxysphingolipids)诱导内质网(ER)应激与细胞毒性依赖于超长链神经酰胺(Ceramide)的合成
研究背景与立题依据
鞘脂(Sphingolipids)是细胞膜重要组分之一，也参与信号转导，其从头合成始于内质网(ER)中丝氨酸与棕榈酰辅酶A在丝氨酸棕榈酰转移酶(serine palmitoyltransferase, SPT)催化下的缩合。病理状态下SPT可误用丙氨酸替代丝氨酸，生成缺乏C1位羟基的1-脱氧鞘脂(1-deoxysphingolipids, 亦称"headless"鞘脂)，因缺C1-OH既不能加亲水头基生成鞘磷脂或糖鞘脂，也不能被鞘氨醇激酶磷酸化为S1P(sphingosine-1-phosphate)进入最终降解途径，导致胞内蓄积并产生神经毒性。1-脱氧鞘脂升高见于遗传性感觉自主神经病Ⅰ型(HSAN1, 由SPTLC1/SPTLC2致病突变致底物偏好偏移)、Ⅱ型黄斑毛细血管扩张症(血清丝氨酸降低)、2型糖尿病相关周围神经病及紫杉醇/多西他赛化疗诱导周围神经病，但其下游致死机制不明。此前已知1-脱氧鞘脂可激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)引发ER应激，但具体代谢转化步骤不清。本研究旨在明确1-脱氧鞘氨醇(1-deoxysphinganine, DoxSa)产生毒性的必需下游生物合成步骤及是否通过诱导ER应激介导细胞死亡。
发表期刊
《Journal of Biological Chemistry》
主要关键技术方法
研究人员采用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系，进行以下关键实验：(1)全基因组CRISPR-Cas9敲除(GeCKO v2文库)正向筛选——以1-脱氧鞘氨醇为选择压力，MAGeCK算法分析富集sgRNA鉴定抵抗毒性基因；(2)CRISPR-Cas9单基因靶向构建TECR功能缺失敲低(KD)与CERS2功能缺失敲除(KO)细胞克隆，经Sanger测序与Western blot验证；(3)高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)定量检测细胞内源性神经酰胺及外源1-脱氧二氢神经酰胺(1-deoxydihydroceramide)、1-脱氧神经酰胺(1-deoxyceramide)谱；(4)碘化丙啶(propidium iodide, PI)活死细胞荧光成像与PrestoBlue法检测细胞活力/死亡率；(5)基于XBP1 mRNA剪接的绿色/红色比率荧光传感器及Western blot检测UPR标志分子——剪接型XBP1(XBP1s)与CHOP(DDIT3, pro-apoptotic transcription factor)；(6)RNA-seq转录组分析1-脱氧鞘氨醇处理前后ER应激/UPR相关基因表达变化。
研究结果
Genome-wide CRISPR/Cas9 screen for genes mediating 1-deoxysphinganine toxicity（全基因组CRISPR/Cas9筛选介导1-脱氧鞘氨醇毒性的基因）
研究人员首先确认1-脱氧鞘氨醇对SH-SY5Y细胞的低微摩尔浓度特异性毒性（对照正常鞘氨醇sphinganine无毒）。以GeCKO v2文库转导Cas9稳定表达SH-SY5Y细胞，1–4 μM 1-脱氧鞘氨醇处理3周，MAGeCK分析sgRNA富集度。前10位hits中8个为脂代谢相关基因：ACLY(ATP citrate lyase)、ACACA(acetyl-CoA carboxylase alpha)、HLCS(holocarboxylase synthetase)、ELOVL1(ELOVL fatty acid elongase 1)、HSD17B12(hydroxysteroid 17-beta dehydrogenase 12)、PTPLB(phosphatidic acid phosphatase type 2B)、TECR(trans-2,3-enoyl-CoA reductase)、CERS2(ceramide synthase 2, 偏好C22–C24脂肪酸)。RNA-seq显示SH-SY5Y中CERS2占CERS总表达约2/3，CERS5/CERS6约占30%。结论：1-脱氧鞘氨醇毒性依赖超长链脂肪酸(very-long-chain fatty acid, VLCFA)延伸循环及CERS2催化的超长链神经酰胺合成，推测1-脱氧鞘氨醇被CERS2酰化生成超长链1-脱氧神经酰胺是毒性前提。
Establishment of cell lines deficient in genes within the very-long-chain ceramide synthesis pathway（建立超长链神经酰胺合成通路缺陷细胞系）
以CRISPR-Cas9靶向TECR（VLCFA延伸末步还原酶）和CERS2（超长链神经酰胺合酶），获得TECR KD（5-bp缺失→移码提前终止，蛋白剩余~30%）与CERS2 KO（A插入→移码，蛋白未检出）。两株细胞基础增殖略慢于WT。结论：成功构建超长链神经酰胺合成关键基因功能缺失细胞模型。
Ceramide levels in TECR KD and CERS2 KO SH-SY5Y cells（TECR KD与CERS2 KO细胞中神经酰胺水平）
MS定量显示：TECR KD细胞中C24/C24:1超长链神经酰胺显著降低，C16/C18/C20短链神经酰胺代偿升高，总神经酰胺不变；CERS2 KO细胞中C22/C22:1/C24/C24:1超长链神经酰胺近完全缺失，总神经酰胺显著下降。结论：TECR或CERS2缺失特异性损害超长链神经酰胺合成，但影响模式不同。
1-Deoxyceramide production in SH-SY5Y cells with an impaired very-long-chain ceramide synthesis pathway（超长链神经酰胺合成受损SH-SY5Y细胞中1-脱氧神经酰胺的生成）
外源添加1-脱氧鞘氨醇后，WT细胞产生主要C22/C22:1/C24形式超长链1-脱氧二氢神经酰胺及1-脱氧神经酰胺；TECR KD与CERS2 KO细胞中这三种形式均显著减少（CERS2 KO在前体1-脱氧二氢神经酰胺阶段即降低更明显）。胞内外分布检测显示约80%–90% 1-脱氧鞘脂保留于细胞内。结论：超长链神经酰胺合成缺陷细胞将1-脱氧鞘氨醇转化为有毒超长链1-脱氧神经酰胺的能力受损，且毒性主要为细胞自主性的。
The very-long-chain ceramide synthesis pathway is required for 1-deoxysphinganine toxicity（超长链神经酰胺合成通路是1-脱氧鞘氨醇毒性所必需的）
1 μM 1-脱氧鞘氨醇处理48 h，WT细胞PI阳性死细胞比例显著升高；TECR KD与CERS2 KO细胞死亡比例较WT显著降低。PrestoBlue剂量-存活曲线显示两株突变细胞对1-脱氧鞘氨醇耐受性显著高于WT。结论：阻断超长链神经酰胺合成（TECR或CERS2失活）使细胞抵抗1-脱氧鞘氨醇诱导的死亡，证明该通路为充分毒性表现所必需。
The very-long-chain ceramide synthesis pathway is required for 1-deoxysphinganine–induced ER stress（超长链神经酰胺合成通路是1-脱氧鞘氨醇诱导ER应激所必需的）
XBP1剪接荧光传感器显示1-脱氧鞘氨醇使WT细胞Green/Red比值升高（UPR激活），TECR KD与CERS2 KO无变化。Western blot证实WT中XBP1s与CHOP均上调，突变细胞中不升高。RNA-seq热图显示WT中DDIT3(CHOP)、CHAC1、TRIB3、STC2、HERPUD1等ER应激/UPR基因显著诱导，TECR KD中减弱，CERS2 KO中几近消失。结论：1-脱氧鞘氨醇诱导的ER应激（IRE1–XBP1臂及CHOP上调）严格依赖超长链神经酰胺合成通路；不能生成超长链1-脱氧神经酰胺则不发生UPR过度激活。
讨论与结论翻译总结
研究人员指出，过量1-脱氧鞘脂蓄积见于HSAN1、2型糖尿病、黄斑毛细管扩张症Ⅱ型及化疗诱导周围神经病。全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定到VLCFA延伸（ACLY、ACACA、ELOVL1、HSD17B12、PTPLB、TECR）与CERS2为介导1-脱氧鞘氨醇毒性的核心通路。TECR KD（部分残余蛋白）呈中度抵抗，CERS2 KO（完全缺失）抵抗更强但仍存高浓度下残余毒性，提示超长链1-脱氧神经酰胺为主要毒性决定因子但不排除其他CERS非依赖作用。SH-SY5Y以CERS2为主表达超长链神经酰胺合酶，体内不同神经细胞类型（神经元高表达CERS1，施万细胞/少突胶质细胞高表达CERS2）可能影响该通路贡献。1-脱氧鞘脂主要胞内滞留，少量分泌不排除旁分泌效应。结果与既往FB1（fumonisin B1，神经酰胺合酶抑制剂）抑制减轻1-脱氧鞘脂毒性、酵母中C26 > C16/18 1-脱氧神经酰胺毒性及化疗神经病中超长链1-脱氧神经酰胺关联发现一致。极长链1-脱氧神经酰胺因更强疏水性滞留于ER膜、扰乱膜包装与分泌运输，引发不可逆ER应激→CHOP途径凋亡。局限性为仅SH-SY5Y细胞模型未行原代神经元或动物验证，未直接测试外源单一1-脱氧神经酰胺代谢产物。最终结论：超长链神经酰胺合成通路是将1-脱氧鞘氨醇转化为超长链1-脱氧神经酰胺并充分诱导ER应激与细胞毒性所必需的；干预该通路（如CERS2或VLCFA延伸酶）可作为减轻1-脱氧鞘脂蓄积相关神经代谢疾病 neurot毒性的潜在治疗策略。
