《Journal of Bone Oncology》：Extracellular vesicles in osteosarcoma: bridging resistance, immunity, and clinical translation
骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是儿童、青少年及年轻成人最常见的原发性恶性骨肿瘤，过去四十年其5年生存率改善有限，局限性疾病约为60%–70%，转移或难治性病例则低于30%。化疗耐药与免疫抑制性肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）互为强化屏障，阻碍疾病的持久控制，而细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）已成为连接肿瘤内在耐药、微环境重塑与转移的关键介质。在MISEV2023框架下，OS来源EV研究面临独特方法学挑战，包括矿化基质干扰、非囊泡颗粒污染、血小板来源EV干扰及分离流程异质性。尽管如此，标准化且适配OS的EV工作流程有望提升EV作为候选液体活检生物标志物的可靠性，用于化疗反应评估、预后分层、免疫状态评价及微小残留病（Minimal Residual Disease, MRD）导向的监测。机制上，EV可通过转运ATP结合盒（ATP-Binding Cassette, ABC）转运蛋白及调控性非编码RNA（non-coding RNAs, ncRNAs）传播化疗耐药，通过铁死亡抵抗、脂质合成、自噬诱导休眠及干性获得等过程重编程代谢与细胞命运，重塑骨髓与肺前转移灶，并通过巨噬细胞极化、血管异常化及限制T细胞浸润促进免疫抑制。新兴EV治疗策略包括工程化EV或外泌体模拟物用于药物与核酸递送、抑制或清除肿瘤来源EV，以及结合免疫治疗的EV疫苗概念。然而，多数治疗证据仍处于临床前或假说生成阶段，受限于随机性货物装载、EV异质性、可扩展的临床级生产、年龄特异性考量及有限的临床验证。本综述整合当前EV介导的OS化疗耐药、免疫重塑及临床转化相关证据，旨在为未来EV生物标志物开发与治疗探索提供关键框架。
骨肉瘤细胞外囊泡研究围绕耐药、免疫与临床转化展开，全文主体内容如下。
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引言
1.1 骨肉瘤流行病学与治疗停滞：生存率长期平台期
骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，呈双峰年龄分布，发病高峰分别位于青春期生长突增期与老年阶段。自20世纪70年代基于大剂量甲氨蝶呤、多柔比星与顺铂的新辅助化疗联合手术切除显著改善了局限性疾病患者结局，成为OS治疗的里程碑，但此后四十年局限性疾病5年总生存率仅维持在60%–70%，未获重大提升。初诊即伴肺转移或治疗中复发、难治的患者预后极差，5年生存率通常低于30%。与传统血液系统恶性肿瘤相比，OS生存改善明显滞后，早期肺转移与化疗耐药难治性是治疗失败与OS相关死亡的核心驱动因素。剂量强化或单纯更换化疗药物的传统策略未能突破这一停滞，存在明确且长期的临床未满足需求。标准MAP方案下约30%–40%患者表现为原发无应答或治疗中快速获得耐药，除肿瘤细胞内在遗传与表观遗传适应外，复发OS的纵向基因组分析显示化疗压力可驱动特定耐药亚克隆扩增，形成侵袭性与转移潜能更强的细胞群，如何在群体与亚克隆水平精准识别并干预耐药演化，是打破OS长期生存平台期的关键科学挑战。
1.2 免疫抑制性肿瘤微环境与化疗耐药的交互作用
除细胞内在耐药机制外，OS高度免疫抑制的TME是有效治疗的另一主要障碍。多组学与病理证据表明OS属于免疫“冷”肿瘤，效应CD8+T细胞浸润不足，M2极化肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）与髓系来源抑制细胞（Myeloid-Derived Suppressor Cells, MDSCs）显著富集。同时OS细胞主动重塑局部代谢微环境，形成酸性与缺氧微环境，上调程序性死亡配体1（Programmed Death-Ligand 1, PD-L1）等免疫检查点分子，削弱抗肿瘤免疫活性。免疫抑制与化疗耐药并非独立现象，而是通过多条通路相互强化：化疗诱导的应激可上调PD-L1等免疫检查点分子，改变细胞死亡形式，减少损伤相关分子模式（Damage-Associated Molecular Patterns, DAMPs）释放，共同削弱肿瘤细胞的免疫识别与清除；耐药亚群往往表现出更强的免疫逃逸能力与更稳定的免疫抑制表型。化疗压力下OS可能形成以耐药演化与免疫逃逸为核心的自我维持恶性循环，单纯细胞毒性杀伤难以实现持久疾病控制，识别沿耐药-免疫-转移轴发挥中枢调控作用的新分子节点对推进OS精准治疗至关重要。
1.3 细胞外囊泡作为连接化疗耐药与肿瘤免疫的机制枢纽及本综述概述
在此背景下，EV日益被认为是连接肿瘤内在适应性过程与微环境重塑的关键介质。EV是由多种细胞主动分泌的纳米级膜结合囊泡，可包裹蛋白质、脂质、DNA片段及包括microRNA（miRNA）、长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）与环状RNA（circular RNA, circRNA）在内的各类ncRNA，通过循环介导短距离与长距离细胞间通讯。近年OS及其微环境来源的EV研究迅速扩展，OS分泌EV被证实可重塑肺成纤维细胞与前转移灶，促进远处转移；其他实体瘤研究也将EV描述为TME内的特洛伊木马，突显其在播散耐药信号与促进免疫逃逸中的隐蔽作用。化疗耐药中，EV介导的多药耐药蛋白、代谢酶及调控性ncRNA的转运已在多项临床前研究中被证实可在细胞群中传播耐药表型并与临床治疗反应相关。肿瘤免疫方面，循环外泌体PD-L1水平已被确定为OS患者预后与肺转移风险的独立预测因子，并可反映肿瘤负荷与免疫抑制状态；同时骨髓基质细胞、癌相关成纤维细胞与免疫细胞来源的EV被证明可调节铁死亡、自噬与免疫细胞极化。本综述基于现有工作，特别强调EV介导的化疗耐药与肿瘤免疫的交互作用，从疾病链视角整合证据，涵盖：基于MISEV2023指南讨论OS来源EV的分离、表征与研究标准，聚焦骨来源组织与血液成分带来的方法学挑战；总结OS EVs作为液体活检生物标志物在预后评估、治疗监测与免疫分层中的进展；系统阐明EV调控耐药传播、代谢与细胞命运重编程、骨髓与肺前转移灶形成及免疫抑制重塑的分子机制；概述工程化EV药物递送、抑制或清除肿瘤来源EV及EV疫苗等新兴治疗策略，探讨其在OS中的转化潜力；最后提出将EV研究从机制发现推进至临床可用工具的关键挑战与未来方向，关注方法学标准化、异质性解析、年龄特异性考量与监管路径。
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骨肉瘤来源细胞外囊泡的分离、表征与标准化：MISEV2023框架下的挑战与指南
国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）发布的最新MISEV2023指南将EV研究的重点从单纯获取EV转向获取经过严格表征、可重复且可比对的EV实验结果。对OS而言，OS患者循环中的肿瘤来源EV仅占EV总量的一小部分，易被背景信号掩盖，且OS发生于高度矿化的骨环境，样本获取、组织解离及儿童青少年特有处理限制对EV分离与表征提出了额外要求，若忽视这些方法论问题，难以获得可靠的生物标志物数据与机制结论。MISEV2023框架下OS相关EV研究的核心问题包括：如何区分真实EV与非囊泡颗粒；如何在高度异质的细胞模型中选择合适的EV体系；如何建立促进多中心可比性与临床转化的标准化液体活检工作流程。
2.1 MISEV2023下的质量控制：区分EV与非囊泡颗粒
MISEV2023强调在进行功能与组学分析前必须仔细排除非囊泡细胞外颗粒（Non-Vesicular Extracellular Particles, NVEPs）的干扰。OS研究中部分早期研究报道EV富含组蛋白、双链DNA等核成分，并据此提出EV介导基因组水平耐药信息传递的假说，但方法学再评估显示单纯使用超速离心作为唯一分离方法时，凋亡小体、核碎片与较大细胞残片易与大EV共沉淀，这些成分在尺寸范围上与大型EV部分重叠，若不经密度梯度或额外纯化步骤去除，可能在下游RNA测序与蛋白质组学分析中被误判为EV货物，导致将细胞死亡副产物误解为主动EV介导的运输。血浆样本中丰富的可溶性蛋白是另一主要干扰源，若白蛋白、免疫球蛋白与脂蛋白颗粒未被有效去除，不仅会掩盖低丰度肿瘤特异性EV蛋白，还会损害磷酸化信号蛋白与膜蛋白定量分析的准确性，此时若不严格区分EV组分与可溶性组分，外泌体PD-L1等标志物的预后价值与生物学解释可能被混淆。
2.2 骨肉瘤细胞模型图谱：异质性与EV货物谱
OS显著的基因组与表型异质性奠定了实验模型行为的巨大变异性，同时越来越多的研究表明OS中EV相关读数在不同细胞系与实验体系中存在差异，尽管大多数现有证据来自独立研究而非跨模型的标准化头对头比较。已报道的常见OS细胞模型间差异包括颗粒丰度、蛋白质与非编码RNA货物的变异性，以及EV调节TME内受体细胞的能力，这些问题在EV被置于化疗耐药、免疫调节或转移进展背景下时尤为突出，模型特异性表型可能实质性地塑造推断机制。代表性常用OS细胞系及其EV相关特征汇总表明，HOS/TE85作为143B的亲本背景，143B是经激活K-Ras转化的高转移潜能模型，U-2 OS具有中等至高侵袭性并常用于EV-ncRNA调控研究，Saos-2成骨样表型需警惕矿化/骨谱系对EV解释的混杂，MG-63常用于微环境相互作用研究。将EV相关假说与OS模型背景对齐，同时明确承认方法学变异性与模型依赖性偏倚，对最大化OS EV研究的解释力与转化相关性至关重要。
2.3 骨特异性混杂因素：矿化基质与组织解离
OS发生于矿化骨组织，其中基质囊泡（Matrix Vesicles, MVs）与含钙磷酸盐晶体的无机颗粒广泛存在，在密度与尺寸范围上与经典小型EV大量重叠。纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）与透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope, TEM）中若无预处理，钙盐晶体与碎片化矿化颗粒极易被误判为EV，导致颗粒计数人为虚高与尺寸分布偏移。这种干扰不应仅被视为体外假象，而是样本类型依赖的混杂因素，在矿化OS组织块、骨相关肿瘤标本及成骨样或易矿化体外模型中最为突出，因为MVs可浓缩钙离子与无机磷酸盐，为钙磷酸盐成核与羟基磷灰石形成提供受限微环境；相比之下循环血浆样本中矿化颗粒不太可能是主要干扰源，血小板来源EV、脂蛋白、白蛋白、免疫球蛋白与其他NVEPs通常是更相关的混杂因素，但在伴有活跃肿瘤相关骨破坏、治疗诱导坏死或强烈骨重塑的患者中，骨来源矿化颗粒或类MV结构仍应被视为潜在的低丰度混杂因素而非完全忽略。为从骨组织中释放细胞与EV，常用方案依赖高浓度胶原酶、胰蛋白酶及相关酶的长时间消化，此类剧烈消化可部分降解或切割关键EV表面蛋白，导致流式细胞术、蛋白质印迹或抗体捕获平台的信号强度降低，若PD-L1与N-钙黏蛋白等膜蛋白同样受酶消化影响，EV的免疫表型可能被低估，进而影响对肺免疫检查点、免疫逃逸与前转移灶形成相关机制的解释。这些样本类型特异性考量推动了区分组织/矿化丰富EV制备与血浆基液体活检样本的OS适配工作流程的建立。
2.4 分离技术进展与OS液体活检标准化工作流程
EV分离与检测技术的进步将其用途从基础研究扩展到潜在液体活检与伴随诊断应用。微流控平台与表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, SERS）已在血浆EV富集与快速检测中显示出高灵敏度与特异性。为提高跨中心与时间点的EV数据可比性，基于MISEV2023指南并结合EV生物样本库经验、血小板去除研究与血浆EV工作流程研究，针对OS液体活检提出相对统一的操作流程：样本采集与预处理使用ACD或EDTA抗凝管，尽量缩短采血至首次离心间隔，血浆分离后及时加入蛋白酶与磷酸酶抑制剂以保护EV表面与内部蛋白完整性；血小板去除推荐采用经验证的两次中速离心并在适当情况下结合过滤以获得去血小板血浆，避免血小板来源EV对肿瘤EV-miRNA谱定量分析的显著干扰；EV分离富集对血浆样本推荐采用尺寸排阻色谱（Size-Exclusion Chromatography, SEC）作为常规方法，可在有效去除大量可溶性蛋白的同时保留EV完整性与功能，大样本量或频繁监测需求下应在下游分析前在同一工作流程内验证浓缩与缓冲液置换步骤，儿童患者样本量极有限时可依研究目标选择SEC与免疫亲和捕获，尽量避免单独依赖聚合物沉淀法；质量控制与污染评估常规应包括NTA、TEM及CD9、CD63、CD81等EV标志物检测，血浆来源EV还需检测钙连蛋白等细胞内蛋白与载脂蛋白B（Apolipoprotein B, ApoB）等脂蛋白标志物以评估细胞碎片与脂蛋白颗粒污染，可能存在大量矿化基质干扰的样本应评估碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）与骨钙素等成骨蛋白以确定残留基质囊泡或无机颗粒。在此标准化工作流程下生成的EV生物标志物数据将更好地支持OS预后分层、治疗监测、耐药预测与免疫状态评估研究，并为开发EV基伴随诊断工具提供更可靠的技术基础。
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骨肉瘤来源细胞外囊泡作为监测化疗耐药与免疫状态的液体活检平台
随着液体活检技术的持续发展，OS来源EV正逐步从纯粹生物学研究对象转变为反映肿瘤负荷、化疗敏感性与免疫状态的潜在临床指标。近期研究表明EV携带的免疫检查点蛋白、膜蛋白特征、功能性蛋白酶活性与非编码RNA不仅与化疗反应及转移风险相关，还可利用高灵敏度检测平台进行动态监测。本节聚焦与OS化疗耐药及肿瘤免疫密切相关的EV生物标志物类型及其在预后分层、微小残留病导向监测与多组学整合中的应用前景。
3.1 化疗反应与免疫状态的纵向监测
传统肿瘤淋巴结转移分期与基于影像学的评估在预测OS患者对标准MAP方案反应方面存在明显局限，不足以及时捕捉耐药与免疫逃逸的早期事件。基于循环EV的液体活检可能为该问题提供补充途径。预后分层方面，一项纳入67例新诊断OS患者的前瞻性随访研究发现基线血清外泌体PD-L1水平与总生存期及肺转移发生率显著相关，提出的14.23 pg/mL与25.96 pg/mL两个截断值可区分不同无病生存期与总生存期的层级，提示EV表面的免疫检查点蛋白不仅反映肿瘤相关免疫抑制程度，还可能预测化疗或化疗免疫联合治疗的获益程度。化疗耐药监测方面，利用自发性犬OS模型建立的血浆EV蛋白质组图谱显示特定EV蛋白指纹可区分卡铂敏感与耐药个体并与临床结局相关，且耐药细胞释放的EV可将多药耐药表型横向转移至敏感细胞，与血浆中可检测到的蛋白质组变化一致，支持利用EV蛋白特征开发预测化疗反应的无创检测方法。目前相关研究多源于单中心前瞻性或回顾性队列且样本量有限，整体证据水平仍处于早期探索阶段，但共同指向一个趋势：以外泌体PD-L1等免疫相关分子为核心的EV生物标志物有望在传统分期之上提供更动态、更具功能导向性的耐药与免疫状态评估。
3.2 EV亚群、功能活性与膜蛋白组合用于风险分层与微小残留病导向监测
OS的高度异质性使得单一EV生物标志物难以达到足够的灵敏度与特异性。为应对该挑战，近期技术进步聚焦于EV亚群的精细表征，利用多重标记组合描绘不同功能EV群体的表面图谱。利用单EV分辨率的单EV计数亚群蛋白分析平台对OS患者血浆EV进行亚群分析，可同时在单EV水平检测包括CD63、骨形态发生蛋白2、GD2与N-钙黏蛋白在内的多种膜蛋白，以GD2与N-钙黏蛋白等OS相关抗原与间质标记为核心的EV亚群组合可区分转移性与非转移性OS患者。GD2反映肿瘤细胞表型，N-钙黏蛋白则与上皮间质转化及侵袭表型相关，此类多标记共表达亚群可为微小残留病导向监测与高风险转移患者识别提供新途径。更新的研究将概念从静态EV表面标记分析扩展至功能性EV活性评估，开发了基于点击化学介导EV富集的OS EV基质金属蛋白酶活性检测方法，利用靶向LRRC15、GPNMB或B7-H3的EV点击磁珠与反式环辛烯修饰抗体富集OS EV亚群，随后基于荧光共振能量转移肽探针定量富集EV中的基质金属蛋白酶14或基质金属蛋白酶2活性，通过分析六种预定义的OS EV标记/基质金属蛋白酶组合生成个体化OS EV基质金属蛋白酶活性谱，整合表现最优的三种组合建立OS EV基质金属蛋白酶活性评分，在回顾性病例对照队列中可有效区分转移性与局限性OS，且在6例OS患者的纵向分析中EV基质金属蛋白酶活性评分的变化与影像学疾病进展或治疗反应一致。与此同时，基于微流控SERS芯片平台可实现EV中CD63、波形蛋白与EpCAM等膜蛋白的快速多重检测，完成从血浆EV分离到信号读取的工作流程仅需约5小时，检测限约为2 EVs/μL，在区分OS患者与健康对照时诊断准确率约95%。从应用角度看，此类EV膜蛋白组合与基于功能活性的EV检测可用于初诊时的风险分层与转移风险评估、新辅助化疗与术后随访期间的微小残留病导向监测与转移预警，以及与影像学及传统血清标志物整合的早期治疗反应评估。这些技术目前处于实验室或临床前验证阶段，但在高度异质性的OS中展示了构建个体化EV表型指纹与功能活性谱的可行性，为精细化风险分层与患者管理提供了方法学基础。
3.3 EV中的功能性非编码RNA：连接化疗耐药、铁死亡与代谢重编程
EV中包含的ncRNA是肿瘤细胞与微环境之间的关键调控轴。在OS中，近期研究日益强调EV封装的miRNA、lncRNA与circRNA在调节铁死亡、脂质代谢及增殖迁移中的关键作用，为化疗耐药与免疫逃逸提供了新的分子视角。铁死亡方面，外泌体miR-144-3p通过靶向ZEB1促进铁死亡，从而抑制OS细胞增殖、迁移与侵袭，EV miR-144-3p降低可能反映对铁死亡抵抗与化疗相关应激的适应。癌相关成纤维细胞来源EV的circ_0004872相关信号可诱导肿瘤血管内皮细胞发生自噬依赖性铁死亡并增强顺铂敏感性，将癌相关成纤维细胞EV ncRNA货物与铁死亡诱导、血管靶向及化疗敏感性联系起来。骨髓基质细胞EV lncRNA XIST通过miR-655/ATP柠檬酸裂解酶轴促进OS细胞脂质合成与积累，从而支持肿瘤生长与转移。综上，OS相关EV ncRNA汇聚于三个功能模块：以miR-144-3p-ZEB1轴为代表的铁死亡敏感性、以癌相关成纤维细胞EV circ_0004872相关信号为代表的自噬-铁死亡偶联与化疗敏感性，以及以XIST/miR-655/ATP柠檬酸裂解酶轴为代表的脂质代谢重编程，这些ncRNA候选物适合纳入EV生物标志物框架，但其临床效用仍需更大队列的标准化检测与验证。ncRNA生物标志物的临床转化也高度依赖于标准化的分析前与分离流程，血浆制备过程中若血小板去除不充分，血小板释放的EV-miRNA可造成显著混杂，导致部分miRNA出现2至4倍的人为升高，因此在评估OS中EV ncRNA作为耐药或免疫相关生物标志物时，严格遵守血小板去除与EV纯化标准操作规程对减少假阳性与中心间变异至关重要。
3.4 人工智能与多组学驱动的EV基液体活检范式
鉴于单一蛋白或单一miRNA不足以捕捉OS的复杂生物学特征，人工智能与多组学整合正成为EV基液体活检研究的重要方向。当前努力主要集中在两类策略：一是基于理化指纹的无标记EV分类结合机器学习；二是联合建模EV蛋白质组、功能性EV活性谱、EV ncRNA谱与临床参数，构建多参数风险预测工具。代表性例子之一是基于微流控SERS平台的策略，无需预先选择特定抗体，而是利用EV的整体拉曼光谱指纹结合机器学习算法对OS患者与健康人进行分型，诊断准确率约93%，在成本与通量方面具有潜在优势，适用于资源相对有限场景下的筛查应用。在多组学整合方面，现有研究已提供多个互补的生物标志物组分，包括外泌体PD-L1与N-钙黏蛋白、EV亚群谱、EV相关基质金属蛋白酶活性评分、EV ncRNA及转移状态与化疗方案等临床变量，未来可纳入复合模型以预测OS患者预后与转移风险。随着单EV技术的发展，批量EV数据最终可被解卷积以解析特定功能EV亚群的贡献，并在此基础上进一步与放射组学及基因组数据整合，构建更精细的多模态预测框架。目前人工智能与多组学驱动的EV分析仍主要处于概念验证或早期临床前阶段，存在样本量与多中心验证方面的局限，但已为OS EV液体活检从单一生物标志物发现向系统级网络评估的转变提供了初步证据，结合前述标准化分离工作流程与质量控制体系，有望开发候选的个体化监测工具，但其临床实施仍需前瞻性验证、统一的EV工作流程与外部测试的预测模型。
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骨肉瘤中EV介导的化疗耐药与免疫重塑
化疗耐药是OS治疗失败、复发与远处转移的关键原因之一。临床观察到的快速获得耐药现象与体细胞基因突变积累所需的时间尺度不符，提示非遗传机制在耐药确立中起主要作用。同时OS典型的免疫抑制性TME与不良预后高度相关，并与化疗反应紧密交织。近年累积的证据表明EV通过运输耐药决定因子、驱动代谢与细胞命运重编程及重塑局部与远端免疫生态系统，在化疗耐药与免疫逃逸的形成与维持中发挥关键中介作用。图1总结了OS中EV介导的连接化疗耐药、免疫重塑与肺前转移灶形成的主要机制。
4.1 EV介导的耐药决定因子横向转移
4.1.1 ABC转运蛋白与多药耐药表型的播散
多药耐药与P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp/MDR1）与MRP1等ATP结合盒转运蛋白的高表达密切相关，传统上主要归因于基因扩增或转录激活，但在OS中多药耐药常在仅数个化疗周期内出现，难以单独用基因突变解释。研究显示多柔比星耐药OS细胞可通过EV将功能性P-gp蛋白及其编码mRNA转移至原本敏感的受体细胞，使后者在短时间内获得典型多药耐药表型并显著降低细胞内多柔比星水平，表明EV可在肿瘤细胞群中横向传播ABC转运蛋白，在组织水平快速放大耐药克隆的适合度优势。化疗药物本身可诱导囊泡生物发生相关蛋白Rab5与Rab8B的表达失调，从而增加富含ABCB1的EV释放并增强邻近敏感细胞对这些EV的摄取，在化疗压力下加速耐药决定因子在细胞群中的扩散，使非遗传耐药在多个克隆中同步建立。现有证据表明EV介导的ABC转运蛋白及其相关mRNA的转移是OS中非遗传、快速适应性耐药的典型机制之一，但相关数据主要来自体外与动物模型，仍需前瞻性临床队列验证其临床相关性。
4.1.2 调控外排泵与化疗耐药的EV携带非编码RNA
除直接转移蛋白质外，EV还运输可调节受体细胞中耐药相关基因表达的ncRNA，构成另一层面的耐药重编程。顺铂耐药OS细胞释放的EV富含circ_103801，该环状RNA作为特定miRNA的竞争内源性RNA，从而解除对MRP1与P-gp的抑制，上调受体细胞中的这些外排泵并诱导顺铂耐药，直接将EV-circRNA-miRNA-转运蛋白轴与临床相关药物耐受联系起来。此外骨髓基质细胞来源EV携带circ_0004674，可调节miR-342-3p/原纤维蛋白1轴并激活Wnt/β-连环蛋白信号，从而增强OS细胞的外排泵表达与多药耐药能力，提示骨微环境中的非恶性细胞也可通过EV ncRNA通路主动参与塑造肿瘤耐药表型。综上，circ_103801-MRP1/P-gp与circ_0004674-miR-342-3p/原纤维蛋白1-Wnt/β-连环蛋白等代表性轴表明EV携带的ncRNA可整合多条信号通路调节外排泵与存活程序，构成OS中非遗传耐药的重要分子基础。
4.2 代谢重编程、铁死亡与细胞命运调节
化疗药物通常通过诱导氧化应激、DNA损伤与多种细胞死亡程序发挥作用，因此OS细胞的代谢状态与细胞命运选择直接决定其对治疗的敏感性。现有研究表明EV通过建立抗铁死亡网络、诱导自噬与休眠及重塑干性显著影响化疗反应。
4.2.1 EV介导的铁死亡抵抗与脂质代谢重编程
铁死亡是一种铁与脂质过氧化依赖的调节性细胞死亡形式，被认为是逆转化疗耐药的有前景靶点。OS细胞与微环境细胞可利用EV构建铁死亡防御。M2极化巨噬细胞来源的EV富含载脂蛋白C1，可稳定OS细胞中的酰基辅酶A合成酶家族成员2，显著降低脂质过氧化，从而降低对铁死亡诱导剂的敏感性，说明免疫抑制性巨噬细胞通过EV向肿瘤细胞输出抗氧化与抗铁死亡能力，构成化疗耐药的重要来源。成纤维细胞-肿瘤相互作用中，癌相关成纤维细胞来源EV携带的miR-22-3p通过靶向铁死亡相关基因抑制铁死亡并促进顺铂耐药，癌相关成纤维细胞EV富集的miR-21-5p也被证实可抑制铁死亡并促进OS细胞增殖与迁移，表明癌相关成纤维细胞通过EV miRNA轴维持肿瘤对脂质过氧化的耐受。同时骨髓基质细胞EV包含的lncRNA XIST通过miR-655/ATP柠檬酸裂解酶轴促进OS细胞脂质合成与积累，由于ATP柠檬酸裂解酶是将葡萄糖代谢与脂质生物合成联系起来的关键酶，该发现表明骨髓来源EV携带的ncRNA也有助于建立支持肿瘤生长与耐药的脂质代谢基础。综上，M2-EV、癌相关成纤维细胞EV与骨髓基质细胞EV共同构成了以铁死亡与脂质代谢为核心的耐药调控网络，但现有支持证据主要来自体外与动物研究，仍需系统评估其与临床的相关性。
4.2.2 EV诱导的自噬与低代谢休眠
自噬是应激条件下促进细胞存活的关键适应性反应。研究显示骨髓基质细胞EV可在OS细胞中强力激活ATG5依赖性自噬，促进受损细胞器清除并诱导以代谢活性降低、增殖减慢为特征的类休眠状态，此类状态通常对细胞周期依赖性化疗药物较不敏感，使细胞在治疗中存活并可能成为后期复发的储备。现有证据表明EV诱导的自噬与休眠是OS细胞逃避化疗杀伤的重要机制，但这些过程如何在患者中动态演变及其与临床复发模式的关系仍有待利用纵向采样与功能成像方法阐明。
4.2.3 EV诱导的干性与复发潜能
肿瘤细胞干性与复发及远处转移密切相关。人脐静脉内皮细胞来源EV可激活OS细胞中的Notch信号通路并上调Sox2与Oct4等干性相关转录因子，从而增强自我更新与集落形成能力，提示血管内皮细胞可通过EV-Notch-干性轴将OS细胞重编程为干样状态，这可能与化疗后残留细胞的长期存活与复发潜能紧密相关。目前关于EV介导的干性重编程的研究基本局限于临床前模型，尚需评估其在患者样本中的可重复性与预后意义。
4.3 微环境重塑：骨髓龛与肺前转移灶
OS的进展依赖于对原发骨髓龛与远端肺前转移灶的持续重塑。作为关键通讯载体，EV在两个区室均发挥重要作用。
4.3.1 骨髓与血管龛的重塑
在原发骨髓龛中，OS细胞来源EV富含转化生长因子-β，可诱导骨髓间充质干细胞获得炎性间充质干细胞表型，这些炎性间充质干细胞大量分泌白细胞介素6，激活OS细胞中的信号转导与转录激活因子3信号，从而增强肿瘤细胞存活与化疗耐药。白细胞介素6/信号转导与转录激活因子3轴也与免疫抑制及M2巨噬细胞极化紧密相连，从而在功能上将EV来源转化生长因子-β与耐药及免疫重塑联系起来。骨髓基质细胞EV中的lncRNA XIST通过miR-655/ATP柠檬酸裂解酶轴重编程OS细胞的脂质代谢，增加脂质合成与能量储存并促进肿瘤生长与耐药，强调骨微环境细胞可通过EV输出代谢与表观遗传调控因子，为肿瘤细胞存活与耐药提供有利的代谢土壤。血管龛同样深受EV塑造，血清来源EV携带的lncRNA MIAT可促进内皮细胞增殖与病理性血管生成，OS-EV可增强内皮管形成并驱动结构异常的肿瘤新生血管发育，此类异常血管常与灌注不均、间质压升高及缺氧相关，不仅改善肿瘤营养供应，还可能限制免疫细胞浸润，为后续免疫逃逸提供解剖与生理基础。
4.3.2 肺前转移灶的建立
肺是OS最常见且致死性最高的转移靶器官。多项研究表明OS-EV可在肿瘤细胞到达之前重编程肺局部的基质与免疫微环境，从而加速肺前转移灶形成。OS细胞高表达COL6A1并将其选择性包装入EV，摄取富含COL6A1的EV后，肺成纤维细胞被驱动为癌相关成纤维细胞表型并分泌白细胞介素6、白细胞介素8与转化生长因子-β等细胞因子，建立支持肿瘤定植且具有免疫抑制特征的肺微环境。另有研究观察到OS-EV可上调肺组织中CXCL1、CXCL2与CXCL8等多种趋化因子，这可能增强肿瘤细胞与免疫抑制细胞的招募，赋予迁移与存活优势以促进转移定植。综上，在原发骨髓/血管龛与肺前转移灶中，OS相关EV通过转化生长因子-β/白细胞介素6/信号转导与转录激活因子3轴、XIST-ATP柠檬酸裂解酶轴及COL6A1-癌相关成纤维细胞-细胞因子/趋化因子轴等多条通路重塑局部与远端微环境，从而对化疗耐药与转移施加持续驱动影响。
4.4 EV与免疫调节的交互作用：从局部免疫抑制到远端免疫逃逸
OS通常表现为免疫冷特征，包括效应T细胞浸润有限、树突状细胞功能受损及M2极化巨噬细胞富集。虽然直接证明OS-EV作用于T细胞或树突状细胞的证据仍然有限，但现有研究从多方面间接支持其在免疫抑制与远端免疫逃逸中的重要作用。
4.4.1 对树突状细胞与抗原提呈的间接抑制
目前尚无研究直接证明OS来源EV抑制树突状细胞成熟或抗原提呈功能，但与耐药形成相关的工作表明EV介导的P-gp与MRP1上调可减少化疗诱导的细胞损伤与损伤相关分子模式释放，从而削弱免疫原性细胞死亡触发的先天免疫激活，在此背景下树突状细胞接收到的危险信号显著减少，其成熟与抗原提呈能力可能继发性受损。前述转化生长因子-β/炎性间充质干细胞/白细胞介素6轴也可能提供间接影响树突状细胞功能与抗原提呈的细胞因子背景，但仍缺乏OS特异性的EV介导树突状细胞抑制的直接证据，需在免疫 competent 模型中验证。
4.4.2 巨噬细胞极化与免疫抑制-化疗耐药反馈环
前述间充质干细胞-白细胞介素6/信号转导与转录激活因子3轴也可能为肿瘤来源EV促进间充质干细胞与巨噬细胞向免疫抑制表型重编程提供合理通路，从而将微环境重塑与免疫抑制联系起来。反向来看，M2巨噬细胞来源EV含有载脂蛋白C1，可稳定肿瘤细胞中的酰基辅酶A合成酶家族成员2，减少脂质过氧化并抑制铁死亡，增强化疗与氧化应激下肿瘤细胞的存活，共同构成免疫抑制与化疗耐药之间的正反馈环。
4.4.3 血管异常化与限制T细胞浸润
如前所述，EV驱动的血管重塑可能在空间与代谢层面限制T细胞浸润，异常新生血管、灌注不均、间质压升高与慢性缺氧可损害T细胞向肿瘤核心的运输与长期滞留，同时也有利于免疫检查点上调。在OS中这仍是EV维持免疫冷微环境的合理机制，但OS特异性的空间免疫绘图数据仍然有限。
4.4.4 肺前转移灶内的免疫调节
如前所述，OS-EV可通过成纤维细胞活化与细胞因子/趋化因子释放重塑肺前转移灶，从免疫调节角度看这些变化可能有利于抑制性髓系群体的招募并限制效应细胞活性，但OS-EV与CD8+T细胞、自然杀伤细胞或髓系来源抑制细胞等特定免疫细胞亚群的直接机制联系仍定义不足。综上，现有证据表明OS相关EV通过介导耐药决定因子的横向转移、重编程代谢与细胞命运及重塑局部与远端免疫微环境，在化疗耐药与免疫逃逸的形成与维持中占据核心位置。与直接聚焦化疗耐药及转移的机制相比，专门针对OS-EV-免疫细胞相互作用的研究仍相对稀缺，尤其缺乏系统的体内功能验证与临床相关性分析，这一证据缺口为未来阐明EV介导的耐药与免疫重塑联系指明了明确方向，也为开发整合化疗与免疫治疗的EV靶向联合策略提供了理论基础。
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骨肉瘤中基于EV的治疗策略
在OS中EV不仅参与化疗耐药传播、免疫抑制放大与肺前转移灶构建，还固有地具备可利用的生物学特征，如保护性脂双层膜、低免疫原性及一定程度组织归巢能力。基于此双重属性可总结出三大治疗概念：工程化EV或外泌体模拟物用于药物与核酸递送；抑制或清除有害肿瘤来源EV以降低总体EV负荷；将EV改造为癌症疫苗平台。但需首先强调这些策略成熟度差异显著，在OS中EV治疗证据几乎完全处于临床前阶段，而大多数EV产品的临床经验来自非OS疾病或非OS肿瘤背景，因此本节聚焦OS模型的直接证据，明确区分此类数据与其他肿瘤类型的推论，并强调目前限制临床转化的制造、装载、质量控制与监管障碍。图4概括了OS中靶向EV的治疗策略。
5.1 工程化EV与外泌体模拟物作为药物与核酸载体
5.1.1 载药间充质干细胞/骨髓基质细胞EV与外泌体模拟物：来自OS模型的直接证据
间充质干细胞/骨髓基质细胞来源EV及其外泌体模拟物是目前OS模型中发展相对成熟的实验性递送平台。利用人间充质干细胞EV制备的多柔比星负载外泌体在多种OS细胞系中显著降低多柔比星半数抑制浓度，并在异种移植模型中实现更强肿瘤抑制，同时全身毒性降低并显示出心脏安全性信号，该效应与SDF-1/CXCR4轴介导的肿瘤富集相关，提示间充质干细胞EV可能部分缓解剂量限制性毒性，同时保留或增强化疗疗效。为克服天然EV产量固有的限制，通过连续挤压骨髓基质细胞制备外泌体模拟物并负载多柔比星形成的制剂在OS异种移植模型中实现了优于游离多柔比星的抗肿瘤疗效与更低的全身毒性，为外泌体模拟物替代传统脂质体的概念提供了临床前支持。更具靶向性的设计中，通过在骨髓基质细胞EV表面引入骨靶向肽并负载小分子药物构建的骨靶向外泌体纳米颗粒在体内显示出对骨与骨内肿瘤的明确富集，通过调节Keap1/Nrf2/GPX4轴诱导铁死亡从而抑制骨内肿瘤进展且无明显的全身毒性，该策略同时靶向增强化疗敏感性及潜在改善免疫微环境，呼应了早期关于EV介导铁死亡抵抗与免疫逃逸的机制发现。在目前可用的OS特异性临床前数据中，间充质干细胞/骨髓基质细胞来源EV、外泌体模拟
