调节性T细胞工程化嵌合抗原受体亲和力调变增强人CAR-Treg功能

《European Journal of Immunology》：Tuning the Affinity of Chimeric Antigen Receptors Enhances the Function of Human Engineered Regulatory T Cells

　　

含单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）的嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）与其靶抗原的结合亲和力显著高于天然T细胞受体（T cell receptor, TCR）。降低CAR亲和力已被证实可通过限制活化诱导的耗竭并保留连续杀伤抗原丰富肿瘤细胞的能力，改善效应CAR-T细胞的功能。CAR技术也日益应用于调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）免疫治疗，但CAR亲和力对Treg生物学及功能的影响尚不清楚。为探究此问题，研究人员将携带不同HLA-A2亲和力scFv的第二代CAR构建体转导至纯化的人Treg中，并在体外及体内比较其特性。高亲和力（high-affinity, HA）CAR-Treg在抗原结合后表现出更高的亲合力（avidity）及更显著的CAR下调；相比之下，低亲和力（low-affinity, LA）CAR-Treg显示出增强的抗原特异性活化和更优的抑制能力。上述差异在人及小鼠精密肝切片（precision-cut liver slice, PCLS）和异种移植物抗宿主病（xenogeneic graft-versus-host disease, GVHD）小鼠模型中得到验证。LA CAR-Treg比HA CAR-Treg在组织中有更多聚集/持久性、延迟GVHD发生并改善存活率。研究结果表明CAR亲和力强烈影响CAR-Treg功能，为优化工程化Treg疗法及现有细胞产品的基准评估提供了重要依据。

本文发表于《European Journal of Immunology》，研究背景如下：CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）占外周CD4⁺T细胞的5%–10%，是维持免疫稳态、防止致死性自身免疫的关键细胞，可通过分泌抑制性细胞因子、IL-2螯合及吞噬（trogocytosis，啃食）抗原提呈细胞表面的肽–MHC复合物和共刺激分子发挥免疫抑制功能。多克隆（polyclonal, PC）Treg过继回输已在移植物抗宿主病（graft-versus-host disease, GvHD）、1型糖尿病及器官移植中显示安全性与一定疗效，但缺乏抗原特异性限制了其靶向归巢与局部抑制效力。嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）可赋予Treg组织特异性识别能力，使CAR-Treg优先归巢至靶组织并发挥局部免疫耐受重建作用。目前CAR各组分（铰链区、跨膜域、胞内信号域）对CAR-T细胞的影响已有较多研究，而单链可变区片段（single-chain variable fragment, scFv）亲和力对CAR-Treg表型、稳定性及功能的影响尚未明确。在效应CAR-T细胞中降低scFv亲和力可提高选择性并减少耗竭，但在CAR-Treg中是否存在类似规律、机制如何，是本研究拟解决的问题。

研究人员构建了针对HLA-A*02:01（HLA-A2）的低、中、高亲和力scFv第二代CAR（含CD28共刺激域和CD3ζ信号域，连接eGFP报告基因），转导自健康供者分选的HLA-A2^?CD4⁺CD25^hiCD127^lo天然Treg，比较低亲和力（2D4/LA）与高亲和力（B11/HA）CAR-Treg在体外活化、抑制功能、精密肝切片（precision-cut liver slice, PCLS）组织浸润、异种GVHD小鼠模型体内存活及持久性、亲合力（avidity）、CAR内化与trogocytosis等方面的差异，发现降低scFv亲和力显著增强CAR-Treg的抗原特异性活化、抑制能力、组织浸润与体内持久性，机制涉及HA CAR更强结合导致更快CAR内化降解及较弱trogocytosis，而LA CAR利于快速解离与再触发。

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主要关键技术方法：

研究人员从健康供者白细胞单采物中分选HLA-A2^?CD4⁺CD25⁺CD127^lo天然Treg进行体外扩增；构建低（2D4）、中（B10）、高（B11）亲和力抗HLA-A2 scFv第二代慢病毒CAR载体（含CD28–CD3ζ–eGFP），转导Treg；采用流式细胞术检测CAR表面表达（HLA-A2–dextramer）、活化标志物（CD69、CD137、GARP）、表型（CD25、Foxp3、Helios）及抑制功能（Teff增殖抑制实验）；利用人及HLA-A2转基因小鼠精密肝切片（PCLS）评估组织内活化与浸润；应用Z-movi微声离心法测定Treg–靶细胞亲合力（avidity）；通过NSG小鼠异种GVHD模型（人HLA-A2⁺PBMC + CAR-Treg过继输注）评估体内持久性、GVHD评分及生存率；检测抗原刺激后CAR下调及Treg对靶细胞HLA-A2和CD86的trogocytosis。

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研究结果：

2.1 Generation of Functional CAR-Tregs With Varying Affinities Toward HLA-A2

研究人员设计并克隆低、中、高亲和力抗HLA-A2 scFv第二代CAR慢病毒载体，转导分选的人天然Treg。三种CAR-Treg表面CAR表达（dextramer⁺比例）相当；用HLA-A2⁺EBV转化B细胞系刺激后，低亲和力2D4 CAR-Treg上调活化标志物最高，中等B10居中，高亲和力B11最低，后续实验聚焦比较LA（2D4）与HA（B11）。

2.2 ScFv Affinity Does Not Influence the Phenotype of CAR-Tregs Upon Stimulation

LA与HA CAR-Treg转导效率（GFP⁺%）及CAR表面表达量（dextramer MFI）无差异。经TCR（抗CD3/CD28磁珠）或CAR（HLA-A2⁺细胞系）活化培养5天后，两者均显著上调CD25与Foxp3并保持Helios⁺表达，表明CAR亲和力不影响CAR-Treg谱系稳定性与基本表型。

2.3 Low-Affinity CAR-Tregs Exhibit Enhanced Antigen-Specific Activation and Suppression

静息状态下LA与HA均无显著基础（tonic）信号；经抗CD3/CD28刺激二者活化与未转导Treg一致。HLA-A2⁺B细胞刺激后，LA CAR-Treg在3 h即显示更高比例的CD69⁺细胞，6 h及24 h晚期活化标志CD137⁺及CD137⁺GARP⁺也显著高于HA。抑制实验中，LA CAR-Treg在HLA-A2抗原存在时对效应T细胞增殖抑制更强，HA抑制较弱，未转导Treg几无抑制，表明LA CAR-Treg具更优抗原特异性活化与免疫抑制功能。

2.4 Anti-HLA-A2 CAR Affinity Regulates the Functionality of Tregs Infiltrating Human and Mouse Liver Tissues

在HLA-A2⁺人肝PCLS中，LA与HA CAR-Treg均被HLA-A2特异激活（CD69上调），但LA活化比例显著高于HA。在HLA-A2转基因小鼠PCLS中，培养18 h后LA CAR-Treg在组织中GFP⁺比例及绝对细胞数较上清升高（提示更好浸润/滞留），HA则相反——组织中CAR⁺比例低于上清，表明HA CAR-Treg组织浸润/保留较差，LA CAR-Treg在人及小鼠肝组织中均显示更佳组织活化与浸润能力。

2.5 Infusion of LA CAR-Tregs Prolongs Recipient Survival in a Xenogeneic GvHD Humanized Mouse Model

NSG小鼠接受HLA-A2⁺人PBMC后，单独输注LA或HA CAR-Treg。LA CAR-Treg体内存续时间更长，对人HLA-A2⁺PBMC植入抑制更明显；LA组GVHD发生延迟且进展缓慢，中位生存期延长，HA组效果较弱，未治疗组迅速发生GVHD死亡，证明LA CAR-Treg在体内具更优持久性与疾病控制能力。

2.6 CAR Affinity Correlates With Overall CAR-Treg Avidity Across Different Cognate Antigen Density Levels

通过Z-movi亲合力测定，HA CAR-Treg与SAL-A2靶细胞整体亲合力（avidity）高于LA，尤其在高HLA-A2密度下差异更大；HA CAR-Treg需更大声学离心力才能脱离靶细胞，表明HA scFv更强结合致CAR–抗原长时间结合、不易解离，LA结合较弱更易快速解离再触发。

2.7 The scFv Affinity Influences CAR Internalization and/or Recycling and Results in Differences in the Trogocytosis of Antigen Presenting Cells

HLA-A2⁺细胞系或PCLS共孵育后，HA CAR-Treg CAR表面表达（dextramer⁺%）下调幅度大于LA，提示强结合致更多CAR内化/降解。trogocytosis检测显示LA与HA均能啃食靶细胞HLA-A2，但仅LA CAR-Treg自身HLA-A2 MFI显著升高；LA还更高效啃食APC表面CD86分子。表明HA强结合→CAR快速内化↓表面CAR→活化减弱；LA弱结合→CAR保留于表面、更好trogocytosis→增强APC免疫原性下调。

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讨论与结论总结：

以往效应CAR-T中降低scFv亲和力可改善连续杀伤并减少耗竭，但CAR亲和力对CAR-Treg影响不清。本研究表明将抗HLA-A2 scFv亲和力降低约60倍（K_D≈ 1–45 nM范围内），可显著增强CAR-Treg抗原刺激后的活化水平、组织浸润、抑制功能及体内持久性。机制为LA CAR-Treg亲合力较低，CAR–抗原作用较弱且短暂，利于快速解离与再触发（serial triggering），减少HA CAR因强结合导致的CAR泛素化、内化及溶酶体降解，从而维持表面CAR表达与信号传导；同时LA CAR-Treg更高效通过trogocytosis清除APC表面共刺激分子CD86，进一步抑制免疫应答。需注意CAR-Treg功能还受CAR架构、靶抗原及Treg本身稳定性影响，结论推广至其他靶点需验证；最佳亲和力阈值依靶抗原密度而定，需逐对确定。作者得出结论：降低scFv亲和力可增强抗HLA-A2 CAR-Treg体外与体内功能——表现为更强活化、更优抑制、更好组织浸润及更长体内持久性；CAR亲和力调变是优化CAR-Treg疗法及既有产品基准评估的重要考量因素，对正在开展的抗HLA-A2 CAR-Treg实体器官移植临床试验具重要指导意义。