《European Journal of Immunology》：Spatial and Phenotypic Heterogeneity of ILC Subsets in Mouse Lung Under Type 2 Inflammatory Conditions
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作为黏膜免疫的关键调节因子，固有淋巴细胞（ILCs）参与组织稳态、炎症和修复。由于这些组织驻留免疫细胞数量稀少，在其原生微环境中研究ILCs仍具挑战性。本研究中，研究人员将循环多重免疫荧光技术——即多表位配体图谱技术（MELC）——应用于系统性IL-33诱导的
作为黏膜免疫的关键调节因子，固有淋巴细胞（ILCs）参与组织稳态、炎症和修复。由于这些组织驻留免疫细胞数量稀少，在其原生微环境中研究ILCs仍具挑战性。本研究中，研究人员将循环多重免疫荧光技术——即多表位配体图谱技术（MELC）——应用于系统性IL-33诱导的2型炎症模型，对小鼠肺部ILC的表型和定位进行时空特征分析。对所有已鉴定细胞类型进行的微环境（niche）分析揭示了四种不同的微环境，并发现混合B细胞和浆细胞/血液内皮细胞（BPC/BEC）微环境在IL-33刺激第3天时出现扩张，而以血液内皮细胞为主导的微环境则有所减少。空间邻域和共富集分析显示，在IL-33介导炎症的早期时间点，ILC2s在髓系细胞丰富的淋巴管周围微环境中聚集。ILC2s与活化的肺泡巨噬细胞和淋巴管直接接触。虽然在稳态条件下ILC2s表达诱导性T细胞共刺激分子（ICOS），但在IL-33刺激第1天和第3天时观察到其组织相容性复合体II类分子（MHCII）的显著表达。与ILC2s不同，自然杀伤细胞/ILC1s在血液血管附近与B细胞和浆细胞共富集。研究人员的发现证明了空间多重成像技术在解析稀有免疫细胞定位和表型方面的实用性，并揭示了早期2型炎症期间ILC微环境的动态、组织特异性重塑。
研究背景与研究意义
固有淋巴细胞（ILCs）是炎症、组织修复和免疫协调的关键调节因子，作为T细胞亚群的天然对应物，具有相似的转录、表型和功能特征。然而，由于缺乏抗原特异性受体，ILCs通过细胞因子、代谢物以及与微环境中细胞邻居的直接相互作用来感知和反应。ILCs包括表达主转录因子TBET、分泌IFN-γ和TNF-α的ILC1s；表达GATA3、分泌IL-5、IL-9和IL-13的ILC2s；以及表达RORγt、产生IL-17A、IL-17F和IL-22的ILC3s。ILCs具有可塑性，能够在不同组织环境中改变其身份。这些细胞数量极少，却在免疫系统中发挥不成比例的重要影响，提示其功能可能依赖于组织内的空间定位和细胞间相互作用。已有研究表明人类ILCs定位于纤维血管微环境，小鼠ILC2s则与外套膜基质细胞、树突状细胞（DCs）和调节性T细胞（Treg cells）共同分布于多种组织的外套膜中。然而，流式细胞术和单细胞测序等解离方法缺乏空间分辨率，而现有低维度免疫荧光技术或配体-受体分析方法又难以提供完整的原位空间信息。
在肺部等屏障表面，免疫反应必须同时确保病原体防护和组织稳态维持，因此炎症诱导的ILC微环境变化尤为重要。IL-33是一种与2型炎症相关的细胞因子，在组织破坏、损伤或失控细胞死亡时释放，能够快速激活和扩增多种器官中的ILC2s。尽管多数研究聚焦于IL-33诱导炎症的后期阶段，但ILCs对警报素如IL-33的快速响应能力及其在屏障组织中的战略性定位，使得研究炎症早期阶段ILCs的空间组织和表型变化变得至关重要。为此，研究人员在《European Journal of Immunology》发表了这项研究，旨在通过系统性IL-33应用后的不同时间点分析，表征ILC亚群、定义其空间微环境，并揭示2型炎症最早阶段的适应性变化。
主要技术方法
本研究采用12-14周龄雌性GATA3eGFP报告基因小鼠（C57BL/6背景），通过连续腹腔注射IL-33建立系统性2型炎症模型，时间点为末次注射后24小时（即IL-33第1、2、3天），并以健康小鼠为对照。核心技术为多表位配体图谱技术（MELC），这是一种循环多重免疫荧光成像技术，使用48个标记物的抗体panel（包括CD127、CD90.2、TBET、GATA3、RORγt、EOMES、ICOS、KLRG1、MHCII、Ki67、CD11c、CD68、CD31、EMCN、LYVE1、PDPN、EpCAM等），结合GATA3eGFP报告基因与抗GFP抗体以增强ILC2检测。成像后采用Ilastik进行像素分类，CellProfiler进行单细胞分割和特征提取，随后利用Seurat流程进行降维、聚类和细胞类型注释。空间分析包括：基于20μm半径的细胞邻域组成向量进行k-means聚类（k=4）的微环境（niche）分析；基于Delaunay三角剖分的空间共富集分析；计算最小细胞距离的邻近性分析；以及10μm半径内的细胞邻域（CIN）分析。统计检验主要采用Kruskal-Wallis检验和Dunn's事后检验。
研究结果
**2.1 利用循环免疫荧光分析系统性炎症以研究小鼠肺部的ILC微环境**
研究人员设计了用于MELC的抗体panel，旨在识别ILCs及其亚型，以及其他免疫细胞和非免疫细胞类型，以便进行ILC的空间邻域分析。通过叠加多种标记组合并评估不同细胞类型的预期共表达模式，验证了染色的可靠性。作为ILCs的通用纳入标记，使用了CD127和CD90.2；ILC特征性转录因子TBET、GATA3、RORγt以及NK细胞转录因子EOMES用于区分ILC1s、ILC2s、ILC3s和NK细胞。研究人员确认了这些转录因子的核定位，并发现其定位于其他ILC纳入标记（如CD127和CD90.2）的细胞质/膜信号内。由于多种GATA3抗体效果不佳，研究人员利用GATA3eGFP报告基因小鼠与抗GFP抗体结合，获得了强烈的GATA3染色，并与ICOS和KLRG1共表达，确认了ILC2和Th2的身份。此外，panel还包括了先前描述的ILC生物学相关标记以及免疫和非免疫细胞标记。
为探究ILC微环境如何受炎症刺激影响，研究人员分析了基于连续IL-33腹腔注射的系统性炎症模型，该模型被描述能够在多种器官中触发强烈的2型反应并激活ST2+ ILC2s。预实验显示ILC2s在IL-33应用第3天显著增加，因此聚焦于炎症极早期时间点（第1、2、3天）。数据采用多种空间分析方法进行处理。
**2.2 利用Seurat流程从循环免疫荧光数据中注释主要免疫和非免疫细胞**
研究人员获取了IL-33应用后第1、2、3天及健康对照的小鼠肺部MELC数据。经过单细胞信息提取、分割和聚类分析，第一级注释（AL1）基于特征谱产生了三个聚类：免疫细胞（高表达CD45及T细胞、B细胞、浆细胞和髓系细胞标记）、内皮和基质细胞（高表达EMCN、CD31、LYVE1、PDPN、Sca1和PDGFRα）以及上皮细胞（高表达EpCAM和CD138）。通过将注释细胞类型的质心叠加于免疫荧光图像上进行视觉验证，确认了注释的准确性：免疫簇质心定位于核信号上方， majority共表达CD45+；血管和基质簇质心展示不同内皮和基质标记的共表达；上皮簇质心定位于主要限于支气管腔上皮层的EpCAM染色区域。
**2.3 三种ILC亚型被解析，ILC2s是小鼠肺组织中的主要亚型**
为增加分析粒度以识别ILC亚型，研究人员对免疫细胞和内皮/基质细胞簇分别进行了亚聚类。对于免疫细胞，该方法分离出五个不同的簇，基于特征谱进行注释。CD3? CD127+ CD90.2+簇被注释为ILCs，显示高水平的GATA3eGFP和KLRG1。在ILC亚型中，NK细胞/ILC1s相比ILC2s和ILC3s显示出EOMES、TBET和NKp46的高z评分；ILC2s具有最高的GATA3eGFP、KLRG1、MHCII和Ki67 z评分；ILC2s和ILC3s均比NK细胞/ILC1s显示更高的CD127和CD90.2表达；ILC3s基于高RORγt表达进行注释，但该簇存在CD3污染，提示Th17细胞丰富。视觉验证确认了ILC亚型的正确注释。基质腔室重聚类产生了EMCN+ CD31+血管、LYVE1+ CD90.2+淋巴管和LYVE1+ CD31+血管三种亚型。综上，研究人员在MELC数据中识别了11种不同的免疫和非免疫细胞类型，包括NK细胞/ILC1s、ILC2s和ILC3s。
基线定量确认ILC2s和NK细胞/ILC1s是稳态小鼠肺中的主要ILC亚型。系统性IL-33挑战触发了在第3天达到峰值的稳健炎症涌入，显著增加了总细胞、免疫细胞、ILCs和所有ILC亚型的总数。分析显示ILC2s是IL-33第3天的主要ILC亚群。跨条件的标记表达分析显示，稳态条件下ILC2s的ICOS和CD44 z评分最高，KLRG1也高于IL-33第1和2天，而MHCII、Ki67和KLRG1 z评分在炎症启动后最高。
**2.4 ILC2s定位于混合髓系-淋巴管内皮细胞微环境**
研究人员进一步研究了组织微环境、其细胞组成以及IL-33注射后的变化。基于11种已鉴定细胞类型20μm邻域的微环境分析产生了四个微环境，按其主导细胞谱命名。上皮细胞（81.7%）和血液内皮细胞（85.9%）分别主导各自的微环境；另外两个微环境显示更混合的细胞组成：一个包含高比例的血液内皮细胞（42.2%）和丰富的B细胞及浆细胞（26.1%），命名为混合B细胞浆细胞/血液内皮细胞（BPC/BEC）微环境；另一个混合微环境组成更多样，髓系细胞最为丰富（32.4%），LYVE1表达细胞类型LYVE1 CD31血管（占总细胞24.7%）和LYVE1 CD90.2淋巴管（8.8%），因此命名为髓系/淋巴管内皮细胞（LEC）微环境。
关于ILCs，混合髓系/LEC微环境含有最高比例的ILC2s（占总细胞6.3%），其数量显著高于所有其他微环境，表明ILC2s优先的空间邻域。在混合髓系/LEC微环境中，ILC2s占90.0%，是主要的ILC亚型。相反，NK细胞/ILC1s主要存在于血液内皮微环境（占总细胞1.0%）和混合BPC/BEC微环境（1.9%），而在上皮微环境（0.03%）和混合髓系/LEC微环境（0.5%）中几乎不存在。NK细胞/ILC1s在混合BPC/BEC微环境（占ILC的55.0%）和血液内皮微环境（72.9%）中是主要ILC亚型。ILC3s作为最稀有的ILC亚型，除上皮微环境外（占总细胞0.3%），在所有微环境中均少于0.2%。
比较不同条件下各微环境的丰度，观察到混合BPC/BEC微环境在IL-33第3天显著扩张，同时血液内皮微环境相比所有其他时间点显著减少。血管内皮微环境分析显示血液内皮细胞随IL-33剂量增加而显著减少，同时B细胞和浆细胞在IL-33第3天显著增加，表明内皮微环境在IL-33存在下部分向BPC/BEC微环境转化。混合髓系/LEC微环境和上皮微环境的丰度无显著变化，但混合髓系/LEC微环境内的髓系比例在IL-33第1、2、3天相比对照显著增加，淋巴管在IL-33第3天相比对照显著减少，表明微环境内部的适应性变化。ILC2s在微环境中的频率无显著变化，但IL-2s在混合髓系/LEC微环境中的高频率在IL-33注射后得以保持，且与血液内皮微环境在所有测试条件下的频率显著不同，进一步支持ILC2s在混合髓系/LEC微环境中的优先定位。
**ILC2s定位于与髓系细胞和淋巴管共享的微环境中**
研究人员整合了微环境分析结果，并进行了聚焦于ILC2s与已鉴定混合髓系/LEC微环境细胞类型直接细胞相互作用的空间分析。空间共富集分析揭示了ILC2s与其他ILC2s、淋巴管和髓系细胞在所有条件下的高共富集，但在IL-33第3天显著性最高。视觉检查显示ILC2s定位于CD90.2+ LYVE1+内皮结构附近，以及代表淋巴管和髓系细胞的标记附近。进一步检查确认了ILC2s与CD11c和CD68髓系细胞的直接接触。扩展panel的额外髓系标记确认了ILC2s与LYVE1+ CD90.2+淋巴管邻近，以及与CD45+ CD11c+ CD68+ SiglecF+ CD44+细胞的直接接触，提示活化的肺泡巨噬细胞表型。在与微环境内CD11c+髓系细胞的直接接触中，ILC2s共表达ICOS、MHCII和KLRG1等标记。ILC2s和淋巴管均为稀有细胞类型，在所有鉴定细胞中占1%-4%，而血液血管是最丰富的细胞类型之一，频率超过40%。鉴定的ILC2s定位于淋巴管周围的组织，但很少进入这些血管结构。定量分析确认98.08%的ILC2质心与淋巴管质心的最小距离大于5μm。ILC2s与淋巴管的最小距离从稳态条件下的33μm显著缩短至IL-33第3天的26μm，是所有测量免疫细胞中最小的值，支持ILC2s和淋巴管的共同空间偏好。细胞邻域（CIN）分析揭示了比较对照和第3天条件时，ILC2s和淋巴管10μm半径内髓系比例的显著增加，以及髓系细胞10μm半径内ILC2比例的显著增加，支持三种细胞类型的空间联系及其共享微环境的炎症适应性。
NK细胞/ILC1s的结果显示了不同的空间分布。NK细胞/ILC1与EMCN+ CD31+内皮血管和B细胞浆细胞簇细胞共富集，但共富集评分较小且显著性较低。虽然血液血管是最丰富的鉴定细胞类型（超过40%），而NK细胞/ILC1s仅占0.9%-1.3%，但NK细胞/ILC1s与血液血管的最小距离在稳态条件下仅为10μm，显著小于ILC2s、髓系细胞和Th细胞，且在IL-33第3天降至仅7μm，与其他所有免疫细胞类型相比均存在显著差异。CIN分析还揭示了IL-33第3天NK细胞/ILC1s和血液血管周围10μm半径内B细胞和浆细胞比例的显著增加，以及炎症组织中血管周围NK细胞/ILC1s比例的显著增加。相反，B细胞和浆细胞的CIN分析显示其他B细胞和浆细胞比例下降而血管比例在IL-33第1天增加。这些结果支持了先前微环境分析中的微环境组成和丰度变化，提示IL-33介导炎症期间的组织适应性。
讨论与结论
ILC亚型占免疫景观的不到1%，是稀有的组织驻留群体，能够快速适应局部微环境变化，是免疫和病理的关键调控者。解离方法提供了当前ILC生物学的大部分知识，但尚未揭示如此稀少的群体如何发挥如此深远和不成比例的影响，这提示其效能可能由专业化功能微环境中的独特组织所驱动。
研究人员的分析证实ILCs在组织中并非随机分布，延续了Dahlgren等人先前描述的小鼠肺部ILC2s的支气管-血管定位。然而，本研究扩展了这些发现并证明ILC2s组织于与髓系群体共享的淋巴管周围微环境中。这种ILC2s与髓系细胞在淋巴管周围微环境中的优先定位通过所有进行的分析得到展示和指示，包括20μm细胞邻域微环境分析、10μm半径内细胞比例定量（CIN分析）以及Delaunay三角剖分定义的共富集分析。虽然该微环境在稳态和IL-33诱导炎症早期时间点得以保持，但存在炎症性微环境内的适应性变化，如活化和增殖标记的表达，提示对IL-33注射的功能组成精细化响应。
研究人员证明系统性IL-33应用不仅触发ILC2s的积累，还增加了其与髓系细胞的共定位。研究中的髓系细胞高表达CD68、CD11c和MHCII，很可能代表肺泡巨噬细胞和树突状细胞。这确认了Dahlgren等人关于ILC2s与肺、肝和肾中CD11c+ MHCII+髓系细胞/DCs共定位的报道。此外，ICOS在T辅助细胞簇以及ILC2s和ILC3s中被检测到，但不存在于NK细胞/ILC1s中。跨条件比较，ILC2s在健康条件下ICOS z评分最高。ICOS独立于T细胞和B细胞调节ILC2稳态，是肺和肠道中成熟ILC2s增殖和积累所必需的。研究表明ICOS+ ILC2s对于各种鼻内挑战后的组织保护至关重要。Hrusch等人在博来霉素诱导肺炎症的早期时间点描述了ILC2s和髓系细胞的共享微环境以及肺泡巨噬细胞中ICOSL水平的增加；Kamachi等人则假设ILC2s和DCs通过ICOS-ICOSL在肺部相互作用，其研究中ICOS的下降水平表明了这一点。ILC2s和髓系细胞的共富集、观察到的直接接触以及炎症时间点ILC2s ICOS较低z评分，可能提示了MELC数据中观察到的类似现象。此外，流式细胞术研究表明ILC2s不仅拥有ICOS还拥有ICOSL，这对ILC2s稳态很重要。ILC2s的ICOS-ICOSL结合是促进ILC2s增殖和促炎细胞因子分泌的生存信号，而ICOS表达ILC2s与ICOSL+ Tre的相互作用则抑制炎症超敏反应。在共富集和微环境分析中，淋巴管周围微环境中的ILC2s与Th细胞未显示共富集，这可能提示IL-33介导炎症早期ILC2s通过ICOS-ICOSL的自分泌激活，并可能是ILC2s在特定区域而非整个组织中积累的另一原因。除了肺部ILC2s的活化，连续腹腔注射IL-33触发全身性2型炎症并在各种其他器官中激活和扩增ILC2s，包括小肠、肾脏、腹膜和肝脏，以及活化ILC2s的跨器官迁移。IL-33鼻内给药触发肺部活化ILC2表型，迁移至肝脏。一种潜在情景是ICOS+ ILC2s由淋巴管周围微环境中的ICOSL+ ILC2s和ICOSL+髓系细胞 primed，为跨器官迁移做准备。因此，淋巴管周围位置可能使组织在活化后通过淋巴管快速、容易地退出。然而，这一假设需在后续研究中加以解决，理想情况下使用高分辨率时空方法揭示微环境内动态以及肺部潜在迁移性ILC2亚群的详细信息。
MHCII由ILCs表达，尽管水平低于髓系细胞和B细胞。ILC2s在ILC腔室中显示最高的MHCII z评分，在IL-33注射后第1天和第3天观察到最高z评分。MHCII+ ILCs作为非专业抗原呈递细胞发挥作用，ILC2s和ILC3s均已被证明与T细胞相互作用，例如肺部蠕虫感染或肠道屏障免疫维持的背景中。虽然研究人员偶尔观察到MHCII+ ILC2s与T细胞接近或直接接触，但结果显示IL-33介导炎症早期ILC2s和Th细胞无共富集模式。考虑到Th细胞是适应性免疫细胞，一种解释可能是Th细胞在炎症后期迁移至该微环境。ILC2s、淋巴管和髓系细胞的共富集也与描述这些细胞类型相互作用的研究一致。例如，肺部ILC2s刺激淋巴管（而非血液内皮细胞）通过白血病抑制因子（LIF）-LIFR上调CCL21，为CCR7+免疫细胞通过淋巴管退出组织迁移至淋巴结提供关键迁移信号。淋巴管内皮细胞主动分泌趋化因子如CCL21以吸引CCR7+ DCs和T细胞，存在DCs和淋巴管介导的CCL21反馈环促进跨内皮迁移。MELC分析支持ILC2s与髓系细胞和淋巴管在肺部功能微环境内战略性定位的概念。空间转录组学方法将提供局部细胞类型细胞因子产生和配体-受体相互作用的信息，确认微环境的功能性及其在炎症期间的适应性。
研究人员肺部数据中ILC2s的定量 resulted in ILC2s频率约为免疫区室的5%。这远高于基于已发表研究使用流式细胞术的预期。一般而言，ILC2s的数量高度依赖于年龄、性别和其他环境条件。小鼠肺部该频率被认为非常低；例如，Sadeghalvad等人报告稳态小鼠肺部ILC2s频率约为免疫细胞区室的0.15%。这些差异的一种解释可能是成像区域的选择，研究人员在预筛选大面积组织以寻找ILCs丰富度后，聚焦于血管和上皮结构。淋巴管周围微环境中ILC2s频率的增加，尽管其在整个器官水平上丰度较低，可能解释了稀有细胞类型如何对局部微环境产生重要影响。这也突显了组织中细胞空间分辨研究的重要性，因为这些信息在解离过程中会丢失。
虽然肺部ILC2s在IL-33介导2型炎症早期时间点 resides in peri-lymphatic niches，研究人员的结果表明肺部NK细胞/ILC1s定位于实质区域，与EMCN和CD31标记的内皮血管以及B细胞和浆细胞共富集。肺部NK细胞和ILC1s具有免疫调节功能和病理作用，是IFNγ的强力产生者。Cautivo等人在IL-33注射和蠕虫感染30天后显示了ILC2s在实质区域的 de novo 积累。ILC2s被报道表达IFNγR，并对ILC1s和NK细胞分泌的IFNγ有反应，例如在病毒感染背景中。已证明IFNγ是抑制ILC2s活化和抑制IL-33诱导小鼠2型免疫的相反信号。ILC2s和NK细胞/ILC1s的空间分离微环境可能代表避免稳态和早期2型炎症期间不必要相互作用的天然安全机制；然而，在炎症后期调控ILC2s可能有助于避免过度或慢性ILC2活化。总体而言，后续在炎症后期表征ILC2s微环境的研究有助于了解所描述的实质ILC2s定位如何影响微环境组成。也不清楚实质ILC2s是否源自改变定位的其他肺部ILC2s，或是否从其他器官迁入。炎症后期ILC2频率的增加可能来自其他器官如肠道的ILC2s。例如，肠道炎症ILC2s在IL-25刺激和蠕虫感染期间进入淋巴管，然后进入血液循环，迁移至肺部。肺部迁移性ILC2s在大约第5天增加，提示其到达时间晚于研究人员IL-33模型中研究的时间点。
虽然本研究主要聚焦于ILC2s的空间微环境表征，研究人员也观察到一些已鉴定微环境的整体适应性，包括混合BPC/BEC微环境的显著扩张和血液内皮微环境的减少。这些显著变化出现在IL-33应用第3天。特别是内皮微环境显示了可能指向重塑的变化。例如，在血液内皮微环境内，B细胞和浆细胞、髓系细胞以及LYVE1 CD31血管在IL-33第3天显著增加，同时血液内皮细胞比例下降，提示稳态条件下主要的血液内皮微环境在系统性IL-33注射影响下向BPC/BEC和混合髓系/LEC微环境转化。
总体而言，研究人员的应用了优化用于研究炎症背景下稀有免疫细胞及其微环境的工作流程，并揭示了ILCs的亚型特异性组织微环境。ILC2s、髓系细胞和淋巴管的共享微环境在系统性2型炎症早期时间点得以保持，但经历适应性变化。该方法论可作为后续使用单细胞分辨率空间多重方法在组织尺度上研究稀有细胞的参考和基础。此外，研究揭示了ILCs塑造免疫和病理结果的局部相互作用机制。
