PNPLA6（磷脂酶基因）复合杂合变异导致垂体功能减退与视力丧失

《HUMAN MUTATION》：Compound Heterozygous Variants in the Phospholipase Gene PNPLA6 Cause Hypopituitarism and Vision Loss

　　

摘要：PNPLA6编码一种保守的溶磷脂酶，对维持神经系统完整性至关重要。PNPLA6的双等位基因致病性变异已在表现为共济失调、视力丧失及垂体激素缺乏的个体中被报道。本研究在一例伴生长激素(growth hormone, GH)、促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone, TSH)及促性腺激素缺乏的联合垂体激素缺乏症(combined pituitary hormone deficiency, CPHD)、并伴有视力丧失与神经发育迟缓的10岁女孩中，鉴定出PNPLA6的两个新型复合杂合变异——催化结构域高度保守残基错义替换p.T1115P，以及产生新剪接受体位点的内含子变异p.Pro1142_Ala1143ins14（插入14个氨基酸）。功能验证显示两变异完全废除神经病靶酯酶(neuropathy target esterase, NTE)活性，证实其致病性。目前PNPLA6缺陷致垂体功能减退的机制尚不清楚。研究人员通过小鼠垂体发育及成体动物实验，发现PNPLA6早在胚胎第10.5天(e10.5)即广泛表达于垂体原基SOX2+干细胞中，早于谱系特化，提示其在祖细胞维持及早期分化中发挥作用；新生及成体动物中PNPLA6主要表达于生长激素及促阿黑皮素(pro-opiomelanocortin, POMC)分泌细胞，表明PNPLA6可能影响垂体早期发育及激素分泌细胞的功能。

论文解读：《PNPLA6复合杂合变异致垂体功能减退与视力丧失》

该文由S.V.、M.I.P-M.等作者撰写，发表于Human Mutation。PNPLA6基因编码定位于内质网胞质面的神经病靶酯酶(neuropathy target esterase, NTE/PNPLA6)，系一种高度保守的溶磷脂酶，负责将磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰胆碱去酰化为甘油磷酸胆碱，以维持内质网(endoplasmic reticulum, ER)磷脂稳态。PNPLA6功能缺失可导致从Oliver–McFarlane综合征（严重脉络膜视网膜萎缩、睫毛过长(trichomegaly)、多发垂体激素缺乏）、Boucher–Neuh?user综合征（小脑性共济失调、低促性腺激素性性腺功能减退伴脉络膜视网膜营养不良）到Gordon–Holmes综合征等一系列表型重叠的神经—内分泌—视网膜退行性疾病。既往虽有散发病道PNPLA6双等位基因变异可致联合垂体激素缺乏症(combined pituitary hormone deficiency, CPHD)，但其导致垂体功能减退的细胞学机制及PNPLA6在垂体发育中的时空表达模式均属未知。本文通过先证者新变异的发现与功能验证，结合小鼠垂体发育免疫组化定位，阐明PNPLA6在垂体早期祖细胞及终末分化激素分泌细胞中均有表达，为PNPLA6缺陷相关垂体功能减退提供了发育生物学依据。

主要关键技术方法

研究人员纳入1例阿根廷Hospital Garrahan确诊CPHD合并视网膜病变及神经发育迟缓的10岁女性先证者及其非近亲健康父母组成三家系(trio)。采用定制单分子分子倒位探针测序(single-molecule molecular inversion probe sequencing, smMIPS)下丘脑—垂体相关67基因panel初筛，继而对三家系行全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)及Sanger验证与分离分析；对先证者与父亲外周血RNA行RT-PCR分析剪切变异影响；构建野生型及突变型PNPLA6/pcDNA6表达载体转染HEK293悬浮细胞，通过苯基戊酸酯水解比色法测定NTE特异性酶活性；取小鼠胚胎e10.5/e12.5/e15.5/e16.5、新生(P0)及成体(6周)垂体行石蜡切片免疫荧光共染色，检测PNPLA6与SOX2及各类垂体激素[GH、ACTH、TSHβ、LHβ、FSHβ、PRL]的共定位。

3.1. Clinical Characteristics（临床特征）

先证者为适于孕龄小出生体重(SGA, 1800 g/-2.46 SDS; 42 cm/-2.94 SDS)女童，6岁起出现夜盲、水平性眼球震颤及双眼视力进行性下降至数指，眼底示视神经颞侧苍白、弥漫性脉络膜视网膜萎缩伴骨细胞样色素沉积，OCT示黄斑厚度减薄、中心凹缺如。10岁因生长迟缓就诊，身高125 cm(-1.88 SDS)、骨龄落后(8岁7月)，具高额、浓密长睫毛、短颈等体征。GH激发试验峰值2 ng/mL(<4.7 ng/mL)确诊生长激素缺乏症(growth hormone deficiency, GHD)；FT₄0.77 μg/dL降低伴TSH 2.46 mU/L不被抑制，诊为中枢性甲状腺功能减退；ACTH—皮质醇轴正常；14岁追加诊断低促性腺激素性性腺功能减退(hypogonadotropic hypogonadism, HH)。垂体—下丘脑区MRI结构未见异常。予左甲状腺素、重组人生长激素(recombinant GH, rGH)及雌激素诱导青春期治疗后生长追赶至靶身高。此临床表型符合PNPLA6相关综合征之Oliver–McFarlane样表现。

3.2. Biallelic PNPLA6 Variants（PNPLA6双等位基因变异）

基因panel检出母源错义变异c.3343A>C(p.Thr1115Pro, NM_001166114.2转录本)，WGS补充检出父源内含子深变异c.3428-44G>A(p.Pro1142_Ala1143ins14)，SpliceAI评分0.98预测产生新剪接受体位点致框内插入14氨基酸。Thr1115位于催化域且自人至斑马鱼高度保守；p.T1115P引入刚性脯氨酸破坏α螺旋并丢失Thr1115—Arg1111相互作用(ΔΔG=-2.6 kcal/mol)。两变异分别按ACMG标准判为疑似致病(LP)。Sanger验证证实复合杂合反式遗传。

3.3. Functional Assays（功能实验）

先证者与父亲外周血cDNA的RT-PCR扩出异常大小条带(458 bp vs 野生型416 bp)，证实c.3428-44G>A引发异常剪接。HEK293细胞NTE酶活性比色测定显示，野生型PNPLA6具典型NTE活性，而p.T1115P错义变异体与p.Pro1142_Ala1143ins14剪切变异体均完全丧失NTE酶活性(p<0.05)，证明所检复合杂合变异为功能缺失(loss-of-function, LoF)致病性变异。

3.4. PNPLA6 Is Expressed in the Developing Pituitary and Is Transiently Coexpressed With the Stem Cell Marker SOX2（PNPLA6表达于发育中垂体并与干细胞标记物SOX2瞬时共表达）

小鼠胚胎e10.5垂体原基整体表达PNPLA6，且与核内SOX2⁺垂体干细胞胞质共定位；e12.5背侧Rathke囊袋(Rathke's pouch) SOX2⁺高增殖区PNPLA6表达减弱，腹侧喙部分化区强表达；e15.5/e16.5前叶实质PNPLA6⁺细胞不再与SOX2共标。表明PNPLA6最早出现于未分化SOX2⁺祖细胞，随细胞迁出干细胞微环境并分化为激素分泌细胞后表达持续但SOX2共标消失，提示PNPLA6参与早期祖细胞维持及/或启动分化。

3.5. PNPLA6 Expression Predominates in Somatotropes and Corticotropes in the Anterior and Intermediate Postnatal Pituitary Gland（PNPLA6在生后垂体前叶及中间叶主要表达于生长激素细胞与促肾上腺皮质激素细胞）

P0小鼠垂体免疫荧光双标显示PNPLA6与GH（生长激素，somatotropes）及ACTH/POMC（促阿黑皮素源细胞，corticotropes/intermediate lobe）高度共定位；极少量与TSHβ共标，不与PRL、LHβ、FSHβ共标。成体垂体除上述外偶见少量促性腺激素细胞(gonadotropes)共标。说明PNPLA6在生后及成体主要富集于GH与POMC分泌谱系，支持其对特定激素分泌细胞长期功能或存活的重要性。

讨论与结论

研究人员指出，本例先证者GH、TSH及促性腺激素三联缺乏伴视网膜病变与PNPLA6相关疾病谱相符。小鼠及人胚胎数据表明PNPLA6在e10.5即表达于SOX2⁺垂体祖细胞并在终末分化GH/POMC细胞中持续表达，提示垂体功能减退可源于早期祖细胞维持/分化受损及/或成熟分泌细胞ER磷脂稳态失衡。不同垂体细胞系对PNPLA6缺失敏感性差异可解释激素缺乏组合变异。本文首次提供PNPLA6在垂体发育时空表达的直接组织学证据，并将p.T1115P与c.3428-44G>A两个新复合杂合LoF变异列入PNPLA6致病谱，拓展了对PNPLA6在垂体—视网膜—神经系统中发育功能的认识，为Oliver–McFarlane等综合征的分子诊断与遗传咨询提供依据。结论可归纳为：①PNPLA6新复合杂合变异(p.T1115P; c.3428-44G>A)致NTE活性完全丧失，是CPHD伴视网膜病变的致病原因；②PNPLA6胚胎期广泛表达于SOX2⁺垂体干细胞，生后主要表达于GH及POMC分泌细胞，PNPLA6缺失可通过干扰早期祖细胞分化及成熟分泌细胞功能双重机制引起多轴性垂体激素缺乏。