运动训练刺激富含谷胱甘肽过氧化物酶1（GPX1）的细胞外囊泡释放并促进血管生成

《The FASEB Journal》：Exercise Training Stimulates the Release of Glutathione Peroxidase 1 (GPX1)-Enriched Extracellular Vesicles That Promote Angiogenesis

　　

单次高强度运动可短暂增加循环中具有有益分子货物（molecular cargo）的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）。然而，目前尚无研究全面评估多次耐力运动后采集的血浆中EVs的数量、蛋白质含量及功能。本研究表明，自愿跑轮4周可在末次训练后立即采集时增加小鼠血浆中EVs的数量。这些EVs（ExerVs）富含氧化还原酶，包括抗氧化物谷胱甘肽过氧化物酶1（glutathione peroxidase 1, GPX1）。将ExerVs通过全身系统性注射的方式每周两次、持续4周给予久坐受体小鼠，虽未改变线粒体含量或功能、肌纤维大小或类型，但增加了骨骼肌中的毛细血管密度（capillary density）和灌注（perfusion）。ExerVs在体外还可促进管腔形成（tube formation）和分支延长（branch lengthening），并在体内改善废用期后的毛细血管含量恢复。从GPX1^?/?小鼠中分离的ExerVs缺乏刺激血管形成的能力，而GPX1包封的脂质体（liposomes）则能在体外和体内显著增加毛细血管生长。本研究结果表明，循环中的ExerVs可能以依赖于GPX1的方式对骨骼肌的血管结构和功能产生积极影响。

## 研究背景与目的

耐力运动训练对机体代谢健康、器官功能改善及疾病预防具有广为人知的益处，但运动诱导的组织间通讯驱动全身适应性变化的具体机制尚不明确。研究表明，多种细胞在运动期间释放体液因子或称作"运动因子"（exerkines）进入循环，通过细胞间通讯促进全身健康。尽管单次高强度运动已被证实可刺激小而富含脂质的EVs释放入血（即ExerVs），但关于耐力运动训练对ExerVs数量、蛋白质含量及功能的系统研究仍十分缺乏。特别是，训练后即刻采集的ExerVs在体外和体内的功能尚未得到充分验证。本研究旨在全面检验4周自愿跑轮训练对小鼠血浆EVs数量、蛋白质内容的影响，并评估系统性注射ExerVs对久坐小鼠骨骼肌代谢和结构适应性的作用，以阐明ExerVs是否含有能够模拟运动效应的有益分子货物。

## 主要技术方法

研究采用C57BL/6J雄性小鼠（4月龄）进行4周自愿跑轮训练，GPX1^?/?小鼠（4–6月龄）用于验证GPX1的功能作用。EVs通过尺寸排阻色谱法（SEC）结合超滤法从血浆中分离，经纳米颗粒追踪分析（NTA）、双金鸡纳酸（BCA）法、冷冻透射电子显微镜（Cryo-EM）及纳米液相色谱-质谱联用（nanoLC-MS）进行鉴定和蛋白质组学分析。EVs（3×10⁸颗粒/次，每周两次腹腔注射）或GPX1包封脂质体（单次胫骨前肌注射）给予受体小鼠。采用激光散斑对比成像（LSCI）评估血流灌注，多模态多光子成像验证EVs的骨骼肌定位，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）管腔形成实验评估体外血管生成，免疫荧光检测肌纤维类型、毛细血管密度（CD31⁺）及胶原蛋白沉积，定量PCR和柠檬酸合酶（CS）活性测定评估线粒体含量与功能。

## 研究结果

**训练验证与ExerVs鉴定：** 4周跑轮训练使小鼠体重下降，骨骼肌相对重量、IIb型向IIa型肌纤维转化及毛细血管化显著增加。NTA显示末次运动后即刻采集的ExerVs浓度显著高于久坐对照（SedV），但平均粒径无差异（SedV=104 nm，ExerV=106 nm）。Cryo-EM证实ExerVs具有双脂层结构及胞内物质。nanoLC-MS共鉴定546种蛋白质，ExerVs独特表达97种蛋白质，其中"代谢物转化酶"为最富集类别，特别是"氧化还原酶"（2.08倍富集；原始p=0.0023；假发现率FDR=0.042），包括抗氧化物GPX1、过氧还原蛋白3（PRDX3）和谷胱甘肽S-转移酶ζ1（GSTZ1）。共享蛋白质中，PM20D1等7种上调、DBP等8种下调（Q<0.05或p<0.05）。经典运动因子未在EVs中检测到，但两者均含有抗氧化物（PRDX2、超氧化物歧化酶1(SOD1)、GPX3）、脂联素（ADIPOQ）、热休克蛋白及层粘连蛋白亚基。

**ExerVs增强久坐小鼠骨骼肌毛细血管密度与灌注：** 为验证EVs递送至肌肉，研究人员将tdTomato标记的EVs腹腔注射后，通过多模态多光子成像在骨骼肌胶原富集的间质中检测到其存在。反复注射ExerVs虽未改变线粒体DNA/核DNA比值、CS活性、体重、相对肌肉重量、肌纤维大小、类型组成或毛细血管含量（以纤维数标准化；方差分析p=0.1），但显著增加毛细血管密度（相较于SedV）和爪部血流灌注（相较于磷酸盐缓冲液PBS）。在体外实验中，ExerVs增加HUVECs细胞活力、分支数量和分支长度。GPX1^?/?小鼠的ExerVs则无此效应。蛋白质印迹验证GPX1蛋白在EVs中富集（ALIX标准化后2.98倍）。

**GPX1富集ExerVs加速废用后毛细血管含量恢复：** 在肢体制动14天后再活动3天的小鼠模型中，单次胫骨前肌注射ExerVs虽未影响胫骨前肌重量、肌纤维横截面积（CSA）或胶原蛋白转换，但使毛细血管含量恢复至接近自由活动对照腿水平；SedV亦显示类似效果，而EV耗竭血浆和GPX1^?/? EVs无此作用。GPX1包封脂质体在体外虽未显著影响细胞活力或分支形成，但有效增加分支长度；在体内虽不能恢复肌纤维大小，但能缓解毛细血管退缩。尽管GPX1脂质体显著影响毛细血管含量，但整体肌肉裂解液中基于4-羟基壬烯醛（4-HNE）的活性氧（ROS）水平无变化（LP=1.00，GPX1 LP=1.043；n=6/组，p=0.81）。

**抗阻训练后ExerVs的特征：** 采用电刺激强度训练模型发现，与耐力训练增加ExerV浓度相反，末次力量训练后即刻采集的ExerV浓度显著降低。其蛋白质组学特征亦不同，"蛋白质结合活性调节因子"为最富集类别，虽共享蛋白质中氧化还原酶仍为最富集类别，但线粒体相关抗氧化物GPX1和PRDX3未被检测到。

## 讨论与结论

本研究首次全面证明，4周耐力运动训练可在末次运动后即刻显著增加血浆ExerVs数量，这些ExerVs富含抗氧化物（特别是GPX1），能够在体外和体内促进骨骼肌血管生成。关于运动促进EV释放入血的细胞来源和机制，研究推测反复运动诱导的活性氧可能通过溶酶体功能障碍，促使多泡体（MVBs）向细胞膜融合释放EVs；而PGC-1α诱导的线粒体保护因子增强可能被MVBs捕获，导致抗氧化物的持续富集。值得注意的是，训练后ExerVs的独特蛋白质组学与急性运动后存在差异，GPX1、PRDX3及PM20D1的存在提示训练可能赋予EVs更强的系统性氧化还原平衡调控能力。

研究还对比了耐力与抗阻训练后ExerVs的差异：后者数量减少且缺乏线粒体定位的GPX1和PRDX3，提示不同运动模式可能产生功能特异的EVs，但这一问题尚需进一步探讨。在功能验证方面，ExerVs对久坐小鼠的线粒体生物发生、肌纤维特性等无显著影响，但特异性促进毛细血管密度和灌注，这一血管调控作用在GPX1缺失时被消除，而GPX1脂质体则可模拟该效应。这提示GPX1可能是ExerVs促血管生成的关键效应分子，但其具体机制——是否通过抗氧化依赖性途径或PI3K/AKT等非抗氧化途径——仍需深入研究。

研究的局限性包括：未明确ExerVs的细胞来源（推测可能为内皮细胞或血管周细胞）；SedV与ExerV在废用恢复中效果相似，可能与两者均含抗氧化物及观察时间点选择有关；未直接比较训练与单次运动后ExerVs的功能差异。尽管如此，本研究结论明确：耐力运动训练可诱导释放GPX1富集的ExerVs，这些EVs是骨骼肌血管生成的重要调控因子。因此，ExerVs和/或GPX1装载脂质体可能代表需要血管重建的病症（如废用恢复、缺血或衰老）的新型治疗策略。该论文发表于《The FASEB Journal》。