《The FASEB Journal》：DNA From Neutrophil Extracellular Traps Restricts Group 3 Innate Lymphoid Cells Function in Intestinal Epithelial Repair via CCDC25
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溃疡性结肠炎（UC，ulcerative colitis）中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs，neutrophil extracellular traps）的蓄积与肠上皮屏障完整性受损相关，但NETs如何影响肠上皮修复尚不清楚。本研究揭示了过量NETs导致UC小
溃疡性结肠炎（UC，ulcerative colitis）中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs，neutrophil extracellular traps）的蓄积与肠上皮屏障完整性受损相关，但NETs如何影响肠上皮修复尚不清楚。本研究揭示了过量NETs导致UC小鼠肠上皮损伤的分子机制。研究人员发现UC小鼠循环无细胞DNA（cfDNA，cell-free DNA）水平升高，主要来自NETs副产物（如NET-DNA）。肠道内NET-DNA加重UC症状，而消除NET-DNA的脱氧核糖核酸酶I（DNase I）处理可缓解上述症状。RNA测序分析显示野生型与肽酰精氨酸脱亚胺酶4敲除（PAD4?/?）小鼠间IL-22 mRNA存在显著变化。流式细胞术结果表明NET-DNA主要影响第3组固有淋巴样细胞（ILC3s，group 3 innate lymphoid cells）分泌IL-22（白细胞介素22），其他形式DNA对IL-22表达影响甚微。DNase I处理和PAD4?/?小鼠中IL-22+ILC3s比例恢复，黏蛋白（mucin）、紧密连接（TJ，tight junction）蛋白及Ki67表达显著增加。将ILC3s或小鼠淋巴细胞系MNK3与NET-DNA共孵育可降低IL-22水平。ILC3s表达NET-DNA受体卷曲螺旋结构域包含蛋白25（CCDC25，coiled-coil domain containing protein 25）；然而NET-DNA不影响shCCDC25-MNK3细胞的IL-22分泌。此外，抑制CCDC25下游整合素连接激酶（ILK，integrin-linked kinase）—缺氧诱导因子1α（HIF-1α，hypoxia inducible factor-1α）蛋白可增加MNK3细胞中IL-22产生。最后研究人员建立MNK3与Caco-2细胞的体外共培养体系，NET-DNA处理过的MNK3细胞上清增加Caco-2细胞FITC-葡聚糖通透性并降低ZO-1表达。因此，ILC3s中CCDC25响应NET-DNA降低UC小鼠IL-22水平，负向调控黏膜愈合。
本文发表于《The FASEB Journal》。
研究背景与目的
溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病（IBD）的一种，以慢性复发性肠道炎症为特征。目前临床抗炎治疗未能充分解决黏膜愈合延迟和UC复发问题，促进肠上皮完整性恢复成为新兴治疗策略。白细胞介素22（IL-22）是促进上皮细胞生长、调节通透性及黏液产生的关键细胞因子，肠道中IL-22主要由第3组固有淋巴样细胞（ILC3s）分泌，而DSS诱导的UC小鼠中IL-22+ILC3s比例显著降低，提示ILC3s分泌IL-22的功能被抑制，但具体机制不明。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）在UC患者肠道及血液中过度蓄积并加速疾病进展，其DNA骨架成分NET-DNA可降低IL-22水平，但其作用机制未明。已有研究表明跨膜蛋白CCDC25是NET-DNA的特异性感受器，且初步发现ILC3s表达CCDC25。因此本研究探讨NET-DNA是否通过与ILC3s表面CCDC25结合抑制IL-22分泌，进而阻碍肠上皮修复。
主要关键技术方法
采用DSS诱导的C57BL/6野生型（WT）及PAD4?/?小鼠UC模型，设DNase I腹腔注射清除NET-DNA的干预组；从骨髓分离纯化中性粒细胞并用PMA诱导获得NET-DNA；分选结肠 lamina propria 中CD45+CD3?B220?CD90.2+ILC3s及使用MNK3细胞系替代ILC3s进行体外共孵育；构建shCCDC25慢病毒感染的MNK3稳转株；采用流式细胞术检测IL-22+ILC3s比例；Western Blot检测CCDC25、紧密连接蛋白；免疫荧光检测肠组织ZO-1、Occludin、8-OHdG；ELISA检测血清IL-22、cfDNA、citH3；RNA-seq分析结肠组织差异基因；建立MNK3条件培养基处理LPS刺激的Caco-2 Transwell模型检测跨上皮电阻（TEER）及FITC-葡聚糖通量评估屏障功能。
研究结果
3.1 NET Byproduct NET-DNA Is Elevated in Experimental UC（实验性UC中NET副产物NET-DNA升高）
检测DSS诱导UC小鼠血清cfDNA、citH3（瓜氨酸化组蛋白H3）及氧化DNA标志物8-OHdG（8-羟基-2′-脱氧鸟苷），发现UC小鼠血清cfDNA显著升高且与citH3正相关；UC小鼠中性粒细胞自发及PMA刺激后释放更多NET-DNA及8-OHdG DNA，结肠固有层NETs与8-OHdG共定位。结论：UC小鼠循环中cfDNA主要来源于NETs副产物NET-DNA。
3.2 DNAse I Treatment Alleviates the Symptoms in DSS-Induced UC Mice（DNase I处理减轻DSS诱导UC小鼠症状）
DSS造模同时隔日腹腔注射DNase I降解NET-DNA，结果显示DNase I处理组体重下降减轻、疾病活动指数（DAI）降低、结肠缩短改善、脾指数降低胸腺指数回升、结肠炎性浸润及上皮脱落减轻，结肠固有层中性粒细胞比例无明显变化。结论：清除NET-DNA可缓解UC小鼠肠道损伤，此保护作用不依赖减少中性粒细胞数量。
3.3 NET-DNA Inhibits IL-22 Secretion From ILC3（NET-DNA抑制ILC3分泌IL-22）
RNA-seq显示PAD4?/?小鼠结肠Il-22 mRNA较WT DSS组上调；体外NET-DNA孵育使MLNs中ILC3s的IL-22+比例下降，对Th17及γδT细胞无影响；凋亡DNA不能抑制IL-22分泌而NET-DNA可，且该抑制可被DNase I预处理消除；MNK3细胞经NET-DNA处理后胞内IL-22降低，高8-OHdG修饰的NET-DNA及外源8-OHdG呈剂量依赖性降低IL-22+MNK3比例。结论：NET-DNA特异性抑制ILC3s分泌IL-22，氧化修饰可能是其作用特征之一。
3.4 Depletion of NET-DNA Is Beneficial to Intestinal Epithelial Repair（清除NET-DNA有利于肠上皮修复）
DNase I处理不改变结肠ILC3s总比例，但恢复NKp46+ILC3s及IL-22+ILC3s比例；结肠杯状细胞黏蛋白（Alcian Blue染色）增加；紧密连接蛋白ZO-1及Occludin荧光强度恢复；隐窝上皮细胞Ki67+增殖细胞增多。结论：减少NET-DNA可上调ILC3s源性IL-22，减轻DSS对肠上皮的损伤并促进修复。
3.5 PAD4 Deficiency Shows Ameliorative Effect on DSS-Induced UC Mice（PAD4缺陷减轻DSS诱导UC小鼠症状）
PAD4?/?DSS小鼠相比WT DSS小鼠体重丢失减轻、便血减少、结肠长度更长、组织炎性浸润减轻、胸腺指数回升脾指数下降、外周血WBC/中性粒细胞/淋巴细胞降低、RBC及血红蛋白（HGB）回升、血清IL-22升高MPO-DNA降低。结论：PAD4介导的NET形成加重UC病情，阻断NET生成可模拟DNase I的保护效应。
3.6 PAD4 Deficiency Makes IL-22 Secretion Increased and Contributes to Intestinal Epithelial Repair（PAD4缺陷增加IL-22分泌并促进肠上皮修复）
PAD4?/?DSS小鼠结肠ILC3s比例不变但IL-22+ILC3s及NKp46+ILC3s比例升高；血清LPS（脂多糖）水平降低提示肠通透性改善；黏蛋白分泌增加、Ki67+细胞增多、ZO-1及Occludin表达恢复。结论：PAD4缺失通过解除NET-DNA对ILC3s的抑制恢复IL-22分泌，促进肠上皮屏障修复。
3.7 NET-DNA Inhibits ILC3 to Secrete IL-22 via CCDC25（NET-DNA通过CCDC25抑制ILC3分泌IL-22）
分选ILC3s及Rag1?/?小鼠结肠切片证实ILC3s表达CCDC25；shCCDC25-MNK3细胞中NET-DNA不再抑制IL-22分泌；使用ILK抑制剂（ILK-IN-3）及HIF-1α抑制剂（PX-478）处理MNK3细胞均提升IL-22+比例；NET-DNA处理的MNK3条件培养基无法阻止LPS刺激的Caco-2细胞TEER下降及FITC-葡聚糖通量增加、ZO-1表达降低，外源重组IL-22可逆转此现象。结论：NET-DNA结合ILC3s表面CCDC25激活下游ILK-HIF-1α信号抑制IL-22产生，进而削弱IL-22对肠上皮屏障的保护作用。
讨论与结论总结
既往已知Treg可通过影响巨噬细胞细胞因子抑制ILC3s分泌IL-22，本研究证明NET-DNA可直接抑制ILC3s分泌IL-22。UC患者肠黏膜及血浆中存在过量NETs及cfDNA，本研究在DSS小鼠中证实cfDNA主要源自NET-DNA。DNase I清除NET-DNA或PAD4基因缺失均能恢复IL-22+ILC3s比例、提升黏蛋白及紧密连接蛋白、促进上皮增殖并降低血清LPS，证实NET-DNA清除可改善肠屏障功能。机制上NET-DNA与ILC3s表达的CCDC25结合，激活下游ILK-HIF-1α通路下调IL-22转录或分泌，该抑制效应依赖于CCDC25。研究局限性在于尚未在动物水平验证ILC3s特异性CCDC25缺失的效应。
结论翻译：本研究表明清除NET-DNA可缓解DSS诱导的疾病症状并促进肠屏障结构与功能的恢复；NET-DNA通过CCDC25信号通路抑制ILC3s分泌IL-22，从而损害UC中肠上皮屏障修复；该研究为NET-DNA影响肠屏障功能的机制提供了新见解，也为靶向CCDC25治疗UC提供了理论基础。
