按按蚊(Anopheles albimanus)抗菌防御中免疫与解毒基因受Lola(Longitudinals lacking)转录因子的调控

《Insect Molecular Biology》：Malaria mosquito antimicrobial defence requires immunity and detoxification gene regulation by Lola

　　

摘要：致疟疟原虫(Plasmodium)由部分按蚊(Anopheles)种类传播。媒介胜任力(vector competence)，即蚊虫内在的传播病原体能力，其遗传与免疫基础在冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)和斯氏按蚊(Anopheles stephensi)等主要媒介中已有广泛研究。在冈比亚按蚊中，免疫相关顺式调控元件(cis-regulatory elements)内鉴定到Lola型基序(motifs)；Lola(Longitudinals lacking)转录因子已知参与黑腹果蝇(Drosophila)发育。本研究探究了lola在美洲疟疾媒介——白背按蚊(Anopheles albimanus)蚊体抗菌防御中的潜在作用。研究人员发现，体内敲低lola会损害蚊虫对微生物感染的存活率。同时发现抗菌防御基因的诱导依赖于lola的上调(upregulation)。抗菌肽(AMPs)、C型凝集素(C-lectins)、模式识别受体(PRRs)、Clip结构域丝氨酸蛋白酶及ML结构域蛋白编码基因均表现出对lola上调的依赖性。参与活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成与解毒的酶，以及JNK免疫信号通路组分同样依赖lola上调。这些发现表明lola调控免疫与解毒基因的表达，且蚊中肠中存在JNK信号与lola表达的功能性关联。该通路的失调可能导致病原体入侵增加及疟疾传播增强。

论文解读：按蚊抗菌防御中免疫与解毒基因受Lola转录因子的调控

本研究发表于《Insect Molecular Biology》。疟疾由按蚊传播的疟原虫引起，蚊虫的媒介胜任力取决于其先天免疫系统对病原体的识别与清除能力。目前已知冈比亚按蚊免疫相关顺式调控元件中含Lola型基序，且黑腹果蝇中Lola(BTB/锌指转录因子)参与发育与氧化应激，但Lola是否调控蚊类抗菌防御基因表达尚不清楚。白背按蚊(Anopheles albimanus)是美洲重要疟疾媒介却研究较少。为此，研究人员以白背按蚊为对象，利用RNA干扰(RNAi)敲低lola结合转录组测序(RNA-seq)，探究Lola转录因子在中肠免疫与解毒基因表达调控中的作用，证实lola是蚊类抗菌防御及中肠稳态的关键上游调控因子，为理解媒介胜任力的分子机制提供了新依据。

主要关键技术方法：

研究人员使用白背按蚊Tapachula品系雌成虫，通过体外转录合成靶向lola基因特异片段的双链RNA(dslola)及对照dsGFP进行体内RNA干扰(RNAi)敲低；经活菌(Escherichia coli)和死菌(热灭活E. coli与Micrococcus luteus混合)进行微生物免疫激发；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织表达谱及验证差异基因；取中肠组织进行RNA-seq转录组测序，用STAR比对至AalbS3参考基因组，DESeq2进行差异表达分析(DEG, adj.P.Val < 0.05, |log₂FC| > 1)；用Amplex Red荧光法测定中肠过氧化氢(H₂O₂)水平；以16S rRNA qPCR定量中肠内源性细菌负荷；通过Kaplan–Meier生存分析与Log-rank检验评估存活率差异。

研究结果：

Expression profile of lola in An. albimanus tissues

研究人员通过qRT-PCR检测各组织lola mRNA分布，发现lola在血淋巴细胞(hemocytes)中表达最高，中肠(proventriculus和前中肠在无吸血蚊体中无表达，后中肠有表达)，细菌激发后中肠各区域及脂肪体、血淋巴细胞中lola显著上调，表明lola受免疫挑战诱导且在免疫相关组织中高表达。

Immunity challenge induces upregulation of An. albimanus-lola

研究人员用热灭活革兰氏阳性与阴性混合菌液注射蚊体，3 h后检测发现后中肠(约1.8倍)、脂肪体(约6.1倍)及血淋巴细胞(约1.9倍)中lola显著上调，前胃(约2.9倍)和前中肠(约5.0倍)亦被诱导，证实lola转录水平受微生物挑战正向调控，提示其参与免疫防御。

Expression of An. albimanus-lola is attenuated by dsRNA in the midgut

研究人员注射dslola后，中肠lola在24 h和72 h分别被敲低约73%和92%(vs dsGFP对照组)，证明建立的RNAi体系可有效沉默中肠lola表达，为后续功能研究提供基础。

Attenuation of lola compromises survival after a living microbial challenge

研究人员先注射dslola或dsGFP，24 h后注射活E. coli，追踪存活发现lola敲低组存活率显著低于对照组(Log-rank检验 p = 0.0028)，平均寿命缩短3–6天，表明lola是蚊虫抵抗活菌感染、维持存活所必需的。

lola KD induces differential gene expression after immune stimulation

研究人员对dsGFP和dslola处理组经死菌激发后的中肠做RNA-seq，PCA显示样本按"有无免疫激发"及"有无lola沉默"聚类良好。对比发现免疫激发使dsGFP组292个基因显著上调，其中192个基因的上调严格依赖lola(敲低后不再诱导)，100个不依赖lola，说明lola是大量免疫诱导基因转录激活所必需的转录调控因子。

Genes induced by immune challenge and dependent on lola upregulation / lola-regulated genes induced by microbial challenge

对192个lola依赖上调基因做功能注释：免疫相关占16%(含抗菌肽cecropin C、CLIP-domain serine proteases、C-type lectin、pattern recognition receptors、Dicer-2等)；氧化还原/应激/线粒体相关占3%(peroxiredoxin PRDX1、glutathione peroxidase GPX、thioredoxin TXD17、cytochrome P450 CYP6等)；其余涉及代谢(20%)、转运(8%)、细胞骨架(4%)、复制转录翻译(5%)及未知功能(24%)。qRT-PCR验证6个免疫基因表达趋势与RNA-seq一致，确认数据可靠。

Immunity genes regulated by lola

深入解析差异基因发现lola依赖的免疫基因涵盖：黑化相关(CLIPs、PPF1/2、C-type lectin、cecropin C)；溶酶体途径(NPC1、NPC2、ML-domain protein、HEXA_B、LIPA、LITAF)；JNK MAPK信号通路组分(JNK、kayak/Kay即Drosophila Fos同源物、Buffy、puckered/Puc、Daughter of Sevenless/DOS、Torso)；吞噬/胞葬作用(efferocytosis)相关(Draper、integrins、CD63、ODC1、DUSP)；抗氧化/解毒(PRDX1、GPX、TXD17、CYP6、SQR、OSGIN2、hsp70、ERO1)；模式识别受体等。表明lola既调控免疫效应基因也调控上游信号通路组分的表达。

Molecular functions of lola-dependent immunity genes

GO富集显示催化活性、丝氨酸内肽酶活性、抗氧化活性、解毒及毒物响应等条目显著富集。KEGG提示溶体功能、胞葬作用及MAPK信号通路富集。cecropin关联Imd/Toll通路，Draper与integrins参与吞噬，JNK通路组分(Kay、JNK、Puc、Buffy)依赖lola诱导，提示lola–JNK功能关联；NPC1/2参与脂质转运及Imd/Toll信号；LITAF响应LPS并在按蚊中肠响应卵囊入侵时被诱导。

Some genes from other functional clusters are also regulated by lola

代谢相关(脂酶、神经酰胺代谢酶、胰蛋白酶/糜蛋白酶类、基质金属蛋白酶MMPs、几丁质酶等)、细胞骨架(gelsolin、myosin)、复制转录(Krüppel转录因子、翻译起始因子eIF2、Histone H1)、膜转运(ABC transporters如ABCG4、ABCC4、ABCA3等、离子与糖转运蛋白)及多样功能基因(IGFBP、GPCRs、黏附分子)也受lola调控，说明lola具较广的生理调控谱。

Molecular functions of other lola-dependent genes

对非免疫DEGs做GO分析，富集到几丁质代谢、鞘脂代谢、器官氮化合物代谢、细胞分化、组织形态发生等生物学过程，提示lola还参与中肠屏障维持及相关代谢重塑。

Lola regulates the detoxification process in the midgut

鉴于PRDX1、GPX、TXD17在lola敲低下调，研究人员测中肠H₂O₂含量，发现lola沉默组24 h和72 h中肠H₂O₂泄漏量显著高于对照组(p < 0.0001)，证实lola通过维持过氧化物酶类表达参与ROS解毒，沉默lola削弱中肠抗氧化能力并扰乱氧化还原平衡。

Lola regulates the bacterial homeostasis in the midgut

研究人员以16S rRNA qPCR定量中肠内生菌，lola敲低48 h后细菌负荷较对照组显著升高约0.5倍(p < 0.001)，表明lola参与维持中肠微生物稳态，其缺失导致共生/环境菌过度增殖，佐证lola在蚊虫天然抗菌防御与中肠屏障功能中的作用。

讨论与结论翻译：

综上所述，本研究为Lola转录因子参与蚊类先天免疫反应提供了证据。白背按蚊lola同源物参与调控免疫信号通路及生物过程(包括生物合成、发育、刺激响应及基因表达)，这些功能在蚊与黑腹果蝇间保守。细菌激发诱导的多个抗疟原虫相关基因亦依赖lola表达，提示lola属媒介胜任力相关基因。研究人员鉴定出lola依赖的差异表达基因簇涉及胞葬作用、溶体/吞噬体、自噬、过氧物酶体、JNK信号、内质网蛋白加工及凋亡等，证实中肠lola表达对先天免疫应答激活不可或缺。lola在中肠免疫效应基因上游行使调控功能，其表达变化或多态性可影响多免疫基因共表达进而改变媒介表型。应将Lola纳入已知的蚊类先天免疫转录调控网络中。lola在按蚊属及蚊科中高度保守，其在白背按蚊中的免疫功能与氧化应激响应保守性可能适用于库蚊亚科(Culicinae)，lola对按蚊媒介胜任力的影响或可作用于疟原虫传播及公共卫生防控。