Xylazole对大鼠环磷酸腺苷及单胺类神经递质的影响：体外与体内研究

《Cells》：Effects of Xylazole on cAMP and Monoamine Neurotransmitters in Rats: In Vitro and In Vivo

　　

摘要：Xylazole是一种广泛用于中国兽医临床的镇静镇痛药，因其给药方便且效果确切而受重视。本研究旨在通过体外及体内大鼠模型考察Xylazole对环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）及单胺类神经递质的影响以阐明其作用机制。在大鼠皮质神经元中，Xylazole以浓度依赖性和时间依赖性升高cAMP水平，瞬时增加胞外多巴胺（dopamine，DA）水平随后下降，持续降低胞外去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）水平，并升高胞外5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及其代谢物5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）。与之相反，成年大鼠脑内局部给予Xylazole后，大脑、海马及脑干多个脑区的cAMP、DA和NE水平降低，而5-HT和5-HIAA升高；值得注意的是，小脑组在停药冲洗后出现cAMP延迟性升高，此模式在其他脑区未观察到。上述结果表明：在生后第7天（postnatal day 7，P7）皮质神经元中，Xylazole触发α2-肾上腺素受体（α2-adrenoceptor）依赖性的cAMP升高；而在成年脑区，局部高浓度Xylazole主要引起cAMP抑制性改变，小脑则出现显著的延迟性cAMP升高。由于逆向微透析所用为非生理浓度，体内神经化学改变应视为探索性脑区反应，不能作为特定受体介导机制的证据。

论文解读：

《Cells》发表的这项研究围绕新型兽用镇静镇痛药Xylazole[N-(2,6-二甲基苯基)-1,3-噻唑-2-胺盐酸盐]展开。Xylazole结构与药理作用类似于α₂-肾上腺素受体（α₂-adrenoceptor）激动剂赛拉嗪（Xylazine），临床上用于动物镇静、镇痛及肌松，但其分子机制尚不清楚。环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信号通路及单胺类神经递质——包括儿茶酚胺类多巴胺（dopamine，DA）、去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）和5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及其代谢物5-羟基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）——被认为参与全身麻醉药的调控，但Xylazole对二者的影响未见报道。此外赛拉嗪可能作用于毒蕈碱、5-HT及阿片受体等多靶点，Xylazole是否具有类似多靶点特征亦不明确。因此研究人员开展本研究，旨在明确Xylazole在体外P7皮质神经元中是否经α₂-肾上腺素受体调节cAMP与单胺类递质，并在成年大鼠不同脑区记录局部给予Xylazole后的神经化学变化，为后续机制研究提供假设。

主要关键技术方法：取生后第7天（P7）Wistar大鼠乳鼠皮质原代神经元无血清培养鉴定（MAP-2免疫荧光）；取成年雄性Wistar大鼠（n=6/脑区，共4脑区：大脑、海马、小脑、脑干）立体定位植入微透析导针，恢复后行逆向微透析——人工脑脊液（artificial cerebrospinal fluid，aCSF）基线收集后，以含1 mM Xylazole的aCSF灌注40 min（1 μL/min），收集灌注期（T1）及停药后恢复期（T2、T3）微透析液；体外细胞分组设对照、不同浓度Xylazole（10–40 μg/mL）、赛拉嗪阳性对照及育亨宾（yohimbine，α₂-肾上腺素受体拮抗剂）预孵育+Xylazole组；cAMP定量采用酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），胞外单胺类递质及5-HIAA采用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）检测；数据分析采用双因素方差分析及重复测量单因素方差分析。

研究结果如下：

3.1. Rat Cortical Neurons Culture and Identification——P7大鼠皮质神经元体外培养3 h可见贴壁细胞，第3天出现突起并形成网络，第7天神经元胞体增多、突起相互连接，MAP-2免疫荧光染色证实培养细胞为神经元；CCK-8检测显示各浓度Xylazole处理3 h对神经元存活率无显著影响，排除细胞毒性干扰。

3.2. Effects of Different Xylazole Concentrations on Rat Cortical Neuronal Viability——10–40 μg/mL Xylazole处理与对照组相比细胞活力无显著差异，确认所选浓度可用于后续神经化学检测且不引起细胞死亡。

3.3. Effects of Different Xylazole Concentrations on cAMP in Rat Cortical Neurons——Xylazole使皮质神经元cAMP呈浓度和时间依赖性升高（10 μg/mL于10 min后升高，20–30 μg/mL于5 min后显著升高，30–40 μg/mL于20 min达峰值），与赛拉嗪组时相相似；预先加入α₂-肾上腺素受体拮抗剂育亨宾（10 μM）完全阻断Xylazole引起的cAMP升高，cAMP水平恢复至对照组水平，证明该效应为α₂-肾上腺素受体依赖性。

3.4. Effects of Xylazole on cAMP in Different Brain Regions of Rats——大脑、海马和脑干在Xylazole灌注期及恢复期cAMP均显著被抑制；小脑在灌注期cAMP轻度上升（不显著），停药后早期恢复（T2）及晚期恢复（T3）出现显著延迟性cAMP升高（T3较基线升高约187%），与其他脑区抑制模式截然不同。因使用非生理高浓度且未做体内受体阻断，不能归因于特定受体机制。

3.5. Effects of Different Xylazole Concentrations on Monoamine Neurotransmitters in Rat Cortical Neurons——Xylazole引起胞外DA双向变化：5–15 min短暂升高后逐渐下降至基线附近；胞外NE在前15–20 min稳定后于30 min起持续显著降低；胞外5-HT自10–15 min起持续显著升高，5-HIAA同步持续升高；育亨宾预处理完全取消Xylazole引起的DA、NE、5-HT及5-HIAA变化，提示体外单胺效应均为α₂-肾上腺素受体依赖性。

3.6. Effects of Xylazole on Monoamine Neurotransmitters in Different Brain Regions of Rats——大脑和海马DA在T1显著下降并于T3恢复，小脑和脑干DA无显著变化；四个脑区NE在T1均显著下降后逐渐恢复；大脑和海马5-HT及5-HIAA在T1显著升高后恢复至基线，小脑和脑干无显著变化。因高浓度限制，体内单胺改变为描述性脑区反应。

讨论部分总结：体外P7神经元中Xylazole经α₂-肾上腺素受体耦联Gβγ激活腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）II/IV亚型引起cAMP升高，属非经典α₂信号；成年脑逆向微透析使用1 mM非生理浓度Xylazole，扩散超出靶区且可能作用于多受体系统，故体内cAMP抑制及小脑延迟升高不能确证为α₂-肾上腺素受体介导，可能含回路间接效应。体外与体内cAMP方向相反源于发育阶段差异（P7神经元缺乏上位核如蓝斑 locus coeruleus 的紧张性输入及完整网络反馈）及α₂受体耦联亚型在不同成熟度的差别。体内5-HIAA/5-HT比值受探针插入及短时异氟烷麻醉影响，Xylazole诱导5-HT释放速率可暂时超过单胺氧化酶（monoamine oxidase，MAO-A）代谢能力致比值暂时变窄。研究局限包括未在体内共灌流α₂拮抗剂验证受体介导、未设育亨宾单独对照组、样本量依惯例未做先验效能计算、体外静态培养无体内清除机制故浓度不可直接比较。

结论（译自原文Conclusion）：综上所述，本研究首次提供直接证据表明Xylazole可在P7大鼠皮质神经元中以α₂-肾上腺素受体依赖性方式升高cAMP，并伴有胞外多巴胺短暂增加及5-HT持续性增强。成年脑局部高浓度Xylazole引起脑区特异性的cAMP与单胺类递质改变，其中小脑独特地出现延迟性cAMP升高。关键的是，由于使用了超生理浓度且缺乏体内受体阻断实验，这些体内观察结果不能归因于α₂-肾上腺素受体激活。体外发现建立了机制框架，而体内数据为代表探索性脑区反应谱，需在临床相关浓度下联合药理学拮抗实验加以验证。