《Biomolecules》：Innovative Strategies to Abolish Microbial Persistence in Biofilm Fortresses
编辑推荐：
生物被膜是由嵌入在自身产生的胞外聚合物（EPS）基质中的结构化微生物群落，其形成显著增强了微生物对抗生素、消毒剂和宿主免疫防御的抗性，在临床、工业和环境领域构成重大挑战。与浮游细胞相比，生物被膜相关微生物对抗菌剂的耐受性可增加10至1000倍，导致生物被膜相关
生物被膜是由嵌入在自身产生的胞外聚合物（EPS）基质中的结构化微生物群落，其形成显著增强了微生物对抗生素、消毒剂和宿主免疫防御的抗性，在临床、工业和环境领域构成重大挑战。与浮游细胞相比，生物被膜相关微生物对抗菌剂的耐受性可增加10至1000倍，导致生物被膜相关感染（BAI）的持续存在。这些感染难以根除，原因在于渗透性降低、代谢状态改变以及休眠或持留细胞的存在。抗生物被膜策略可大致分为：靶向生物被膜结构的物理方法（如超声、机械应力和光基方法）；破坏基质稳定性的化学和酶学方法（如EPS降解酶）；以及通过不同作用机制调节生物被膜发育和完整性、靶向调控通路和基质稳定性的生物学和分子策略（如群体感应（QS）抑制剂、抗毒力因子制剂、噬菌体、噬菌体来源的抗微生物分子、抗微生物肽和天然生物活性化合物）。天然化合物包括乳铁蛋白、乳铁蛋白衍生肽、乳酸菌（LAB）的益生菌和后生元组分，以及植物来源代谢物，已显示出有前景的抗生物被膜效果，其疗效常通过互补或潜在协同相互作用而增强。然而，尽管取得这些进展，临床转化仍然有限。例如，BAI约占慢性感染的80%，在器械相关感染和慢性伤口中报告了高复发率和治疗失败率。这些局限性突显了开发临床可转化的多模式方法的必要性，将结构生物被膜破坏、抗 antimicrobial 靶向和宿主反应调节整合起来，以设计更有效和可持续的抗生物被膜策略。
1. 引言
生物被膜代表微生物生命的主导模式和主要挑战，其复杂结构和显著生理异质性共同赋予其对其抗菌干预的卓越耐受性。在分子水平上，生物被膜韧性由EPS介导的保护、QS调控的群体行为、应激适应反应、改变的代谢活性、遗传重组和变异以及持留细胞形成所支持。
在成熟的多层生物被膜中，营养和氧气梯度产生生理异质性亚群，从表层代谢活跃细胞到深层缺氧、营养匮乏区域的慢生长、休眠或持留细胞。休眠生物被膜相关亚群包括表型不同的状态，包括持留细胞、活的非可培养（VBNC）细胞和小菌落变种（SCV）。尽管这些群体共享在不利条件和抗菌暴露下存活的能力，但它们在生理特征、代谢活性、可培养性、持留机制及复苏能力方面存在差异。持留细胞是细菌群体中的瞬时表型变异体，在遗传上对抗生素仍敏感，但通过进入休眠或慢生长生理状态而在抗菌暴露中存活。其耐受性与代谢不活跃、ATP耗竭、应激反应通路激活和生长停滞机制相关。这些细胞在生物被膜中特别丰富，其中营养限制和环境条件进一步促进持留。在环境或抗菌应激因子去除后，持留细胞可重新定殖生物被膜，从而导致感染持续、治疗失败和复发后延。
VBNC状态在Song和Wood（2021）提出某些被归类为VBNC的群体可能代表死细胞而非活的休眠细菌后，成为广泛讨论的主题。作为回应，近期努力寻求标准化VBNC状态的定义："细胞以其可培养性丧失、维持非可培养状态的能力以及复苏潜力为特征"，且日益被认定为慢性和复发性BAI的贡献者。这些标准将VBNC细胞与死细胞区分开来，并为其鉴定提供框架。
SCV是慢生长表型变异体，特征为非典型菌落形态、降低的代谢活性，以及对环境应激和抗菌剂增强的耐受性。某些SCV表现出依赖培养条件的生长需求，包括升高的CO
2条件或特定营养补充，这可能阻碍其在常规实验室条件下的检测。SCV与生物被膜形成和慢性感染密切相关，其中长期应激暴露促进代谢适应和持留。一个充分表征的例子是金黄色葡萄球菌（
Staphylococcus aureus）的CO
2依赖型SCV表型，其在标准培养条件下生长明显受损，但在CO
2富集环境中生长改善。这些生长依赖性表型在生物被膜中尤为重要，其中对营养限制、氧气梯度和环境应激的代谢适应促进SCV的产生。
这些特征削弱了传统疗法的效力，并促成慢性感染、复发和抗菌素耐药性（AMR）的出现。在寻求解决生物被膜持续性的创新策略中，越来越多的注意力被导向使生物被膜能够抵抗抗菌和宿主来源应激的机制。传统抗生物被膜策略包括化学治疗剂和物理破坏方法。
2. 传统抗生物被膜剂——作用机制和当前局限性
传统抗生物被膜策略主要依赖靶向微生物活力或生物被膜结构的化学治疗和物理干预；然而，其临床效果常受生物被膜特异性耐受机制、有限渗透和实践实施挑战的限制。
2.1 化学治疗剂——抗生素
抗生素仍是抗菌治疗的核心，但其在BAI中的功效受生物被膜特异性耐受机制限制。在生物被膜中，抗生素活性因EPS介导的渗透屏障、抗生素螯合或灭活、营养-氧梯度、降低的代谢活性以及休眠或持留细胞而降低。
尽管可获得的抗生素范围广泛，但临床功效主要使用浮游易感性参数评估，主要是测量生长抑制的最低抑菌浓度（MIC）和测量体外条件下细菌杀灭的最低杀菌浓度（MBC）。在生物被膜背景下，补充参数如最低生物被膜抑制浓度（MBIC）和最低生物被膜根除浓度（MBEC）提供更具生物被膜相关性的信息，但这些值可能仍低估体内治疗需求。例如，在骨科植入物相关金黄色葡萄球菌生物被膜中，体内MBEC值显著高于体外MBEC值，且随生物被膜成熟而增加。
频繁引用的10至1000倍的抗生素敏感性降低应被理解为情境依赖性而非普遍的，根据细菌种类、菌株、抗生素类别、生物被膜成熟度和实验条件而变化。这些观察解释了为何对浮游细胞有效的抗生素可能无法在临床可接受剂量下根除成熟生物被膜。
从进化和治疗角度看，MIC水平的抗生素暴露可能允许通过自发突变产生的抗性亚群存活，而超过突变预防浓度的浓度增加在因毒性、组织损伤风险和抗菌残留生态关切而在体内很少可行。为应对这些局限性，联合治疗和多药治疗已成为管理BAI的首选策略，尽管当渗透、时机或局部浓度不足时，即使联合方案也可能无法根除成熟生物被膜。
除治疗失败外，生物被膜还是水平基因转移的关键生态位，促进抗性和毒力决定因子的交换，并促成AMR的传播，包括在ESKAPE病原体中。它们对环境应激因子和广谱抗菌剂的耐受性强化了其作为持续AMR库的作用。
2.2 生物被膜解离的物理方法
物理方法通过靶向生物被膜基质的机械和物理化学特性而非直接杀灭微生物细胞来破坏生物被膜完整性并促进脱落。这些策略包括机械应力、超声和光基方法，在医学、工业和环境环境中作为抗生素的替代或辅助手段。
机械应力策略依靠施加外部物理力（如剪切、压缩、摩擦和流体动力压力）来降低生物被膜基质的内聚强度。当施加应力超过生物被膜的机械破坏阈值时，可导致生物被膜相关细胞的脱落和分散。这些方法的效力与生物被膜的黏弹性相关。
在临床实践中，机械清创（包括外科去除、纱布、灌洗、超声以及自溶或化学清创）仍是管理慢性伤口BAI的广泛使用的策略。尽管外科清创被认为是伤口管理的标准护理，它很少完全消除生物被膜。清创可暂时减少伤口微生物负荷，但生物被膜可能在24-48小时内重新建立，提示物理去除尝试后残留生物被膜常持续存在。
基于超声（US）的方法是另一类具有转化意义的物理抗生物被膜策略，应用于慢性伤口管理、牙科生物被膜控制、医疗器械去污和生物材料相关感染情境。US治疗或超声处理使用高频声波产生能够破坏生物被膜结构的机械力，主要通过影响EPS基质的空化现象。空化涉及生物被膜周围液体介质中微泡的形成、生长、振荡和内爆性崩溃，产生冲击波和高速微射流。此外，超声暴露期间产生的升高的压力和温度进一步促成生物被膜组分的侵蚀和生物被膜基质的破坏。这些效应损伤细菌细胞和EPS基质，同时创建增强抗菌渗透的微通道。
US介导的破坏效力取决于频率、强度、压力、暴露时间和与靶表面的距离等参数，以及与介质相关因素如溶解气体含量、静水压和液体温度。尽管具有潜力，US治疗仍受若干挑战限制：缺乏标准化治疗方案，过度暴露可能导致意外组织损伤；诱导的碎片可能播散活微生物细胞，构成感染扩散风险。近来，US被研究作为辅助策略，因其可增强抗菌剂的渗透和效果。
光基抗生物被膜疗法因其非侵入性、时空精确性和与多模式治疗策略的兼容性而获得越来越多的关注。其中，光动力疗法（PDT）和光热疗法（PTT）研究最为广泛。
PDT依靠涉及无毒光敏剂（PS）的两步过程，在可见光或近红外光激活下产生活性氧（ROS）。产生的ROS对EPS多糖、细胞膜脂质、蛋白质和核酸造成多靶点氧化损伤，最终导致生物被膜基质崩溃和/或微生物细胞死亡。由于这种氧化机制同时影响多个细胞靶点，PDT对细菌、真菌、病毒和原生动物表现出广谱抗微生物活性，包括耐药菌株，并可降解毒力因子、破坏与多重耐药（MDR）相关的表型特征，并干扰生物被膜稳定性所必需的代谢过程。
临床上，PDT已应用于伤口、烧伤、口腔、牙髓和医疗器械BAI的治疗。然而，其临床应用受限于有限的光渗透深度和ROS介导的光毒性风险，主要限制PDT于表面、易接近或器械相关的生物被膜。
PTT是利用局部产热实现抗微生物和抗生物被膜效果的补充性非侵入性光基策略。它使用光热剂或纳米材料（PTAs）将吸收的光能转化为热并引起局部高热。PTT的机制主要通过高热诱导的热消融介导，使蛋白质变性、损伤核酸和破坏膜完整性，物理破坏生物活性基质组分并增强对抗菌剂的渗透性。这种物理作用模式使PTT较不易产生抗药性，因其不依赖特定分子靶点而是物理损伤细菌细胞。
PTT的关键优势在于近红外光相较于其他波长具有更优的组织渗透性，能够治疗更深或更厚的生物被膜，报道的渗透深度可达厘米级。然而，成功应用需要精确控制光强度、暴露时间和PTA浓度，因为过度加热可能损伤周围健康宿主组织。
对于PDT和PTT，与PS和PTA递送、生物被膜渗透和靶向激活相关的挑战继续影响其治疗应用，当前研究将其更多地定位为更广泛的抗生物被膜干预的组成部分而非独立解决方案。
3. 靶向生物被膜完整性和持留细胞的替代策略
新颖和替代策略通过机制不同但部分重叠的途径靶向生物被膜完整性和持续性，强调机制干预而非直接杀菌活性。为概念清晰，这些方法根据其主要生物被膜靶点和主要作用方式分组：胞外基质破坏、群体感应调控通信、噬菌体介导的细菌靶向，以及靶向膜或细胞内的抗微生物肽和细菌素。
3.1 基质降解酶
基质降解酶代表主要的替代抗生物被膜策略，因其直接损害维持生物被膜内聚力的胞外支架。通过选择性降解EPS组分，这些酶可触发主动生物被膜分散，释放能够重新定殖宿主或环境新位点的细胞。治疗上，这种内在过程被利用来削弱保护嵌入和持留细胞的物理和生化支架，从而改善其对抗菌剂和宿主免疫防御的暴露。
研究最广泛的酶包括多糖降解酶，其水解在生物被膜内聚力和架构中起核心作用的基质碳水化合物。包括糖苷水解酶和多糖裂解酶，如α-淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、藻酸盐裂解酶、透明质酸酶和分散素B（Dispersin B）。通过切割EPS多糖内的糖苷键，这些酶减少生物被膜厚度、破坏细胞聚集，并促进成熟生物被膜的脱落。
分散素B是一种特征良好的糖苷水解酶，最初在伴放线放线杆菌（
Aggregatibacter actinomycetemcomitans）中鉴定。它特异性水解聚-N-乙酰葡糖胺（PNAG），这是跨多样细菌类群参与细胞间黏附和生物被膜稳定性的保守基质多糖。其实验研究表明，分散素B能够抑制表面附着、阻止生物被膜成熟、分离预先形成的生物被膜，并使已建立的生物被膜对抗生素、防腐剂、抗微生物肽、噬菌体和宿主免疫机制敏感，突出其在协同抗生物被膜方法中的作用而非作为独立治疗剂。
蛋白质降解酶构成另一重要的基质靶向剂类别。蛋白酶如蛋白酶K、枯草杆菌蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、链霉蛋白酶、金葡菌溶素、溶葡萄球菌酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶和舍雷肽酶水解作为EPS基质基本组分的结构蛋白质。它们还降解参与表面附着的黏附相关蛋白。这种蛋白水解活性导致生物被膜结构完整性丧失和机械韧性降低。
胞外DNA（eDNA）是许多生物被膜基质的关键结构组分，贡献于内聚力、表面附着和机械稳定性。因此，基于核酸酶的方法，包括DNase I、微球菌核酸酶、限制性内切核酸酶、人DNase1L2和原噬菌体编码的DNase，已被研究用于通过降解eDNA和增加对抗菌治疗的易感性来抑制生物被膜形成或分离预先形成的生物被膜。DNase I表现出与抗生素的显著协同效应：eDNA支架的破坏降低基质密度并促进更深层的抗生素渗透，导致相较于单独抗生素处理存活细胞数减少2至15倍。
3.2 群体感应抑制剂和抗毒力因子制剂
QS抑制，常称为群体猝灭（QQ），代表靶向细菌通信系统而非细菌活力的主要抗生物被膜和抗毒力策略。通过干扰QS调控的协调，这种方法可降低致病性、生物被膜成熟度和生物被膜稳健性，而不施加直接杀菌压力。
机制上，QS策略分为三类干预：靶向QS信号分子、靶向QS信号受体，以及阻断下游信号级联。通过破坏信号合成、信号积累、信号感知或下游调控反应，QS抑制剂（QSIs）损害从初始附着到成熟生物被膜架构的转变，并降低QS调控的基质组分、黏附素和毒力因子的表达。
靶向QS信号分子涉及AHL-内酯酶、氧化还原酶和其他降解或修饰信号分子的分子化合物。AHL-内酯酶，由芽孢杆菌属（
Bacillus spp.）的
编码，有效抑制多种细菌物种的生物被膜形成并减弱毒力因子，而AHL-酰化酶通过切割酰胺键降解AHLs，从而降低有效信号浓度并调控QS依赖行为。
QS受体靶向策略通过抑制或竞争性靶向信号受体来发挥作用。许多QS受体表现出保守的配体结合域，这使得结构多样的化合物能够进行药理学干扰。呋喃酮和黄酮类化合物是研究最广泛的QS抑制剂，因其与多种致病菌的QS受体相互作用。
下游QS干扰靶向信号检测后的反应调节因子或转录控制点。Savarin是在金黄色葡萄球菌中鉴定的小分子毒力抑制剂，通过靶向AgrA抑制QS，有效破坏agr操纵子介导的信号传导。同样，virstatin抑制Acinetobacter nosocomialis中AnoR的表达，减弱QS控制的信号级联。
3.3 噬菌体和噬菌体来源的抗微生物分子
噬菌体（或简称为噬菌体）是感染细菌的病毒，作为对日益增长的AMR的回应，已重新成为有前景的抗微生物工具。治疗应用主要依赖裂性噬菌体，其感染细菌细胞并诱导裂解，从而减少活细胞、贡献于生物被膜架构破坏并促进对嵌入细菌的访问。
噬菌体编码去多聚酶，作为游离酶或尾相关蛋白，降解荚膜多糖、胞外多糖和脂多糖组分，促进噬菌体向更深生物被膜层的扩散。这种酶降解削弱生物被膜内聚力，暴露受保护的细菌细胞，并促进进一步的噬菌体复制和生物被膜破坏。
噬菌体来源的酶作为独立或辅助抗生物被膜剂引起相当多的关注。这些包括内溶素、肽聚糖降解酶（包括病毒体相关肽聚糖水解酶（VAPGHs））、去多聚酶、透明质酸酶、DNase和脂肪酶，其选择性降解细菌细胞和生物被膜基质的结构组分。内溶素尤为重要，因为它可以裂解包括代谢休眠和持留细胞在内的细菌细胞。
近来，噬菌体超分子系统（PBS）——将噬菌体与抗微生物肽、纳米材料或其他功能增强剂结合——已被提出来扩大抗生物被膜活性并改善生物被膜渗透。同时，纳米颗粒辅助的噬菌体递送正被越来越多地探索以提高噬菌体稳定性、靶向性、生物被膜渗透和治疗效果。
3.4 抗微生物肽
抗微生物肽（AMPs），也称为宿主防御肽，代表一类多样且进化上保守的先天性防御分子，具有广谱抗微生物和抗生物被膜活性。AMPs通过多种机制发挥抗生物被膜活性：它们可以破坏表面附着、改变外膜蛋白、通过抑制信号分子下调QS分子、破坏生物被膜前体向胞外环境的转运，以及增强宿主免疫反应。
大多数AMPs是阳离子和两亲性的，使其能够与带负电的细菌膜发生静电相互作用，随后发生膜渗透化、孔形成或完全膜瓦解。几种AMPs转位进入细菌细胞，在那里干扰DNA、RNA、蛋白质合成或代谢途径。除了其抗微生物活性，这些化合物还表现出免疫刺激特性，包括作为趋化因子和激活经典补体途径，以及抗炎作用。
人组织蛋白酶抑制素LL-37是唯一的人组织蛋白酶抑制素抗微生物肽和先天免疫系统的关键效应物，主要由中性粒细胞和上皮细胞产生并在感染部位从hCAP-18前体激活。LL-37主要通过膜破坏发挥直接抗微生物活性，同时单独调节宿主免疫反应。
近来的研究强调了具有抗生物被膜潜力的非传统生态库的AMPs。淡水木生真菌如长梗垫孢菌（Longipedicellata megafusiformis）和梭形威克洛菌（Wicklowia fusiformispora）已被鉴定为结构新颖肽的来源。海洋来源的AMPs进一步说明了未充分探索的生态库的价值。
阳离子AMPs是少数被证明可直接靶向持留细胞的抗生物被膜剂之一，由于它们与细胞膜和壁组分的相反电荷组分发生静电相互作用，导致膜孔形成，从而作为抗持留剂发挥作用。这种机制使AMPs能够杀灭居住在生物被膜更深层的代谢休眠持留群体。
4. 天然生物活性化合物——调节生物被膜形成的新兴剂
由于MDR对公共健康构成重大关切，发现和实施新型抗生素替代方案的需求日益迫切。在此背景下，天然生物活性化合物如乳铁蛋白、益生菌、后生元和植物来源化合物，可能成为标准化抗生素治疗的有前景的替代或辅助手段。
4.1 乳铁蛋白
乳铁蛋白（Lf）是一种分子量为80 kDa、具有铁结合特性的糖蛋白，首次在牛乳中鉴定为牛Lf（bLf）。Lf的氨基酸末端提供分子正电荷，并因其与革兰阴性细菌（脂多糖，LPS）和革兰阳性细菌（脂磷壁酸，LTA）的带负电细胞壁组分的相互作用而确保杀菌功能。
当Lf结合革兰阴性细菌的LPS时，其导致LPS释放，破坏细胞表面并引起高膜渗透性，从而使细胞暴露于渗透冲击或抗生素的杀菌活性。在革兰阳性细菌中，Lf与LTA的相互作用诱导表面电荷丧失和膜完整性破坏，允许溶菌酶对肽聚糖的酶促降解。乳铁蛋白素（LFcin）和乳铁蛋白肽（LFampin）是通过胃蛋白酶消化从Lf氨基末端产生的抗微生物肽。这些小的两亲性分子具有α-螺旋构象，与天然蛋白类似带有阳离子电荷，这解释了它们的抗微生物活性。
Lf的抗生物被膜机制包括铁螯合依赖性效应——铁对生物被膜形成和活力至关重要，Lf可通过螯合铁减少生物被膜存活。此外，还发现了几种物种特异性的铁非依赖性抗生物被膜机制：在牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）中，bLf的抗蛋白酶活性负责其生物被膜抑制效应；在肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）中，Lf的DNase活性与其防止黏附的能力一起，在生理浓度下根除了已建立的生物被膜；Lf还可能通过抑制调控生物被膜形成的毒力因子基因luxS的表达来破坏生物被膜。
4.2 益生菌和后生元
4.2.1 益生菌——特性和作用机制
益生菌是通过多种活动使宿主受益的活微生物，包括调节免疫和炎症，以及在特定条件下抑制病原体黏附和诱变。最著名和用于人类治疗的益生菌属包括革兰阳性的乳杆菌属（Lactobacillus）、链球菌属（Streptococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、片球菌属（Pediococcus）、乳酸球菌属（Lactococcus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium），以及革兰阴性的大肠杆菌Nissle 1917株和布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii）株。
乳杆菌属和双歧杆菌属是发育中肠道菌群的重要组成，广泛用作益生菌属。乳杆菌属代谢己糖产生乳酸，生成酸性条件；还可产生过氧化氢和苯甲酸，阻断过氧化氢酶阴性和酸敏感病原体的黏附。此外，LAB可产生细菌素，通过竞争性排斥附着于宿主细胞上的病原体受体，并抑制QS系统。
4.2.2 后生元和益生菌代谢物——特性和作用机制
"后生元"被定义为"无生命微生物和/或其组分对宿主健康有益"的制剂。已研究多种后生元的抗生物被膜作用，包括无细胞上清液（CFS）、短链脂肪酸（SCFAs）、细胞壁片段、胞外多糖、生物表面活性剂和胞外囊泡（EVs）。
CFS代表益生菌培养物的液相，通过过滤去除细胞获得，含有多种代谢物。LAB产生的CFS具有酸性，因物种和代谢途径不同产生多种有机酸。CFS的抗生物被膜活性与多种后生元化合物的联合作用相关，包括乳酸、H2O2、细菌素和其他抗微生物代谢物。
乳酸的杀菌作用源于细胞内外酸性条件的产生、膜完整性损伤和基因组DNA及QS信号的改变。过氧化氢是几种LAB株合成的抗微生物物质，引起氧化应激，导致DNA和细胞损伤及随后的死亡。细菌素是革兰阳性细菌（包括LAB）以及革兰阴性细菌核糖体合成的AMPs，具有低分子量和广谱抗细菌及抗生物被膜机制。SCFAs包括肠道细菌发酵过程中产生的乙酸、丙酸和丁酸，已被证明影响细菌毒力和生物被膜发育。LTAs是革兰阳性细菌细胞壁片段的例子，具有生物被膜抑制活性。胞外多糖是LAB生长过程中合成的高分子量、长链聚合物，其抗生物被膜效应可通过体外干扰细胞通信来证明。生物表面活性剂是两亲性化合物，通过LPS结合阻止细菌黏附并降低细胞表面疏水性。EVs作为后生元组分，越来越多地被认为与益生菌株的抑制活性相关。
4.3 天然抗生物被膜化合物类别（萜类、酚酸、黄酮类、生物碱）
植物来源的生物活性化合物因其对细菌致病和生物被膜发育的有前景的抑制效应而获得关注。治疗潜力主要归因于其丰富的次级代谢产物库，这些产物表现出显著的化学和结构多样性。这些次级代谢产物中的六类主要植物化学物质因其显著的抗生物被膜潜力而被认可：生物碱、萜类、黄酮类、皂苷、酚酸、单宁和挥发油。
4.4 天然化合物抗生物被膜效果的机制
植物次级代谢产物表现出强抗生物被膜活性，通过多种互补机制干扰生物被膜发育的关键阶段。在分子水平上，植物化合物穿透生物被膜基质，通过形成微通道和微孔诱导结构改变，从而促进其在整个生物被膜中的扩散。内化后，这些化合物通过损伤细胞壁和与细菌细胞壁蛋白相互作用，破坏磷脂双层并增加膜渗透性，导致细胞内容物泄漏、破坏必需膜功能，最终影响基因调控、离子平衡和信号通路改变而导致细胞裂解和死亡。
同时，植物化学物质可导致DNA和RNA改变，抑制DNA复制、转录和翻译所涉及的关键酶促过程，从而抑制基因表达、细胞内代谢和细胞增殖。它们对翻译的干扰和随后对蛋白质合成的抑制进一步减少EPS产生、毒力因子表达和QS自诱导物合成，损害QS系统和ATPase活性，从而损害细胞协调以及生物被膜成熟和群体组织。
此外，植物来源化合物通过表面抗黏附机制干扰微生物黏附，从而防止早期生物被膜形成并降低BAI风险。天然化合物还可通过破坏质子梯度来抑制外排泵系统，导致外排泵活性受损和抗微生物物质的细胞内保留增强。增加膜渗透性促进抗微生物剂的细胞内渗透。通过抑制编码菌毛、鞭毛和curli结构组分的基因，植物化学物质降低微生物运动性、细胞间聚集和生物被膜分散。
抗生物被膜活性可概念化为涉及生物被膜组织的基质、细胞和调控水平协调作用的分层、多级过程。在基质水平上，植物来源化合物主要通过破坏EPS来靶向生物被膜结构完整性，形成微通道和微孔，减少EPS和藻酸盐产生。在细胞水平上，植物化学物质直接损害微生物细胞完整性和代谢，破坏细胞壁和膜，增加膜渗透性，导致细胞内化合物积累、细胞内容物泄漏、质子梯度破坏和外排泵系统损害，抑制关键代谢酶和ATPase活性。在调控水平上，天然化合物调节协调生物被膜发育和群体行为的遗传和信号通路，抑制QS系统、毒力因子表达、EPS生物合成和运动性。
4.5 天然生物活性化合物之间的协同作用/与抗生素/抗微生物策略的协同作用
4.5.1 天然生物部分化合物之间的协同相互作用
近年来，越来越重视协同组合使用天然和合成治疗剂以提高抗生物被膜效果。协同作用指两种或更多种药剂之间的相互作用，其联合效果大于各单个效果的总和。
几项研究探索了涉及乳铁蛋白和整个LAB细胞及其代谢物如细菌素或CFS的协同相互作用。例如，Lf对LAB菌株的益生作用以及bLf-LAB组合的抗微生物作用已被报道，表现出显著的生长抑制效应。与细菌素nisin联合使用时，Lf增强了这种细菌素对革兰阴性细菌的活性。bLf/nisin混合物抑制铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）生物被膜的效果达79.70%，而单独化合物分别仅达58.02%和30.34%。
在植物成分的组合方面，结构化和功能异质性的生物被膜使得具有不同抗生物被膜机制的植物成分组合越来越被研究作为实现有效生物被膜控制和根除的策略。联合使用天然化合物已被证明通过靶向早期黏附过程和破坏已建立生物被膜中的固着细胞来增强抗生物被膜效果。
4.5.2 天然生物活性化合物与抗生素/抗微生物策略的协同组合
考虑到Lf和Lf衍生AMPs作为预防剂的潜力，研究转向将这种铁螯合糖蛋白与抗生素联合使用以管理MDR感染。观察到的协同或互补作用主要通过Lf或Lf AMPs增加抗生素的膜渗透性，或抗生素促进AMP与外膜结合来解释。
早期研究证明了LFcinB增强红霉素在大肠杆菌中杀菌作用的能力。合成的人Lf衍生肽hLf1-11使肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）株的表型转变为对通常因无法穿透外膜而对革兰阴性病原体无效的疏水抗生素易感。越来越多的证据表明，天然生物活性分子与常规抗生素的联合给药显著增强抗微生物特性。
5. 当前挑战、视角和未来研究方向
尽管非传统抗生物被膜方法取得重大进展，但转化为常规临床和工业实施仍受共同限制：生物被膜异质性、适应性抗性通路、递送障碍、安全性/耐受性问题和监管复杂性。重要的是，生物被膜群体部署分层保护机制，常削弱单一药剂或单一模式干预，强化了整合性、多靶点设计的必要性。
基质降解酶代表通过直接靶向赋予机械稳定性和耐受性的胞外聚合物支架的基础抗生物被膜策略。然而，其临床实施受情境依赖性疗效限制，这随生物被膜组成、细菌菌株、生长条件、酶浓度和暴露时间而变化，而大规模生产、制剂稳定性、向致密EPS的渗透和成本仍是显著障碍。一个关键且常被低估的限制是，EPS基质的酶促破坏可能诱导主动生物被膜分散而非细菌杀灭，释放具有定殖潜力的活细胞，从而产生增加的播散风险瞬时窗口。因此，基质降解酶必须与其他杀菌剂联合使用以防止播散和继发感染。
QSIs和QQ方法代表概念上有吸引力的抗生物被膜策略，通过靶向细菌通信和毒力调节而非活力。然而，其转化面临重要生物学和实际限制，因为QS系统具有高度物种特异性且常分层组织，信号通路冗余，这限制了QS靶向剂在复杂或多微生物生物被膜中的广度和可预测性。
噬菌体疗法和噬菌体来源的抗微生物分子代表生物学上精确的抗生物被膜策略；然而，其临床转化受复杂抵抗机制和实践限制。这些限制包括受限于窄宿主范围、不完整的药代动力学和药效学特征、免疫原性、监管和伦理约束，以及大规模生产、制剂、储存和靶向递送的挑战。
AMPs代表具有快速、多靶点作用模式的多功能抗生物被膜策略；然而，其临床转化仍受抗性、稳定性、安全性和递送限制。细菌可通过包膜结构重塑、肽降解、外排激活、膜屏蔽或表面修饰来响应AMP易感性。同时，较高浓度下的细胞毒性或脱靶效应、蛋白水解不稳定性、短半衰期、高生产成本、潜在免疫原性，以及通过致密EPS基质的有限扩散继续限制其更广泛应用。
尽管已证明有抑制效应，革兰阳性和革兰阴性病原体已获得多种抵抗机制或策略来阻断Lf和Lf肽的抗微生物和抗生物被膜活性。例如，几种革兰阴性肠道细菌可对Lf表现出表型抗性，其机制在于LPS的O-抗原链可能屏蔽膜孔蛋白受体。金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌等革兰阳性细菌可通过表面蛋白和黏附素结合apo-hLf和LFcin的活性位点，从而阻断其杀菌作用。
后生元在缺乏有效靶向生物被膜嵌入细菌的载体的情况下，可能不是经典抗生物被膜剂的理想替代品，而是互补策略。此外，后生元的合成并不恒定，因为其组成和效果可能因批次而异，这进一步支持其作为辅助而非独立标准化药物的使用。
尽管天然生物活性化合物作为抗生物被膜剂的兴趣日益增长，仍存在若干重要限制。大多数当前数据来源于体外研究，不能完全复制生物被膜的复杂性。植物来源的变异性、提取方法、化学成分和实验方案的不一致性导致缺乏标准化。某些植物化学物质可能呈现过敏或细胞毒性效应。此外，几种天然化合物已被报道具有不良的生物利用度、快速降解和低水溶性，显著限制其抗生物被膜效果。
微纳马达技术已作为机械应力驱动的抗生物被膜策略出现，包括磁驱动微型机器人、光激活分子马达和超声微马达，能够通过局部机械作用渗透和破坏生物被膜基质。这些观察支持从以试剂为中心的抗生物被膜策略向具有改进递送系统、适应生物被膜结构、组成和生理状态的上下文感知多模式策略的范式转变。
6. 结论
生物被膜相关感染仍是主要公共卫生关切，由于抗微生物耐受性增加、持留以及表型和遗传韧性的发展。本综述总结的证据突显了组合策略的潜力，涉及天然生物活性化合物（乳铁蛋白、益生菌、后生元和植物成分）和/或标准化试剂，通过互补作用机制增强抗生物被膜效果。
区分生物被膜预防和根除、缓解无杀灭的分散等风险，以及考虑耐受驱动的存活机制的进化后果，对任何未来疗法的转化成功至关重要。未能整合这些考虑的策略可能无意中促进持续性或抗性发展。
展望未来，抗生物被膜治疗的进展将较少依赖于新抗微生物剂的发现，而更多依赖于开发和组合策略，以解决生物被膜发育阶段并限制进化逃逸通路。采用系统级方法控制生物被膜对于解决微生物耐受和持留，以及拦截将生物被膜存活与抗微生物抗性发展联系起来的进化轨迹至关重要。
