用于生成稳定表达岩藻糖缺失(afucosylated)抗体细胞群体的基因敲减(knockdown)方法比较——靶向α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的miRNA与shRNA在CHO细胞中的评价

《mAbs》：Comparison of knockdown approaches for the generation of stable cell populations expressing afucosylated antibodies

　　

摘要：在稳定表达分泌型重组蛋白的细胞系中对特定细胞基因进行靶向沉默，是调控产品质量属性(Product Quality Attributes, PQAs)的一种灵活便捷策略。然而，与基因敲除(knockout)或使用强效抑制剂消除酶活性不同，利用微RNA(microRNA, miRNA)或短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)进行基因敲减(knockdown)可能仅能部分降低酶活性，导致目标产品质量属性仅发生部分改变。此外，shRNA可能因饱和Dicer通路而产生细胞毒性，影响产物得率。本研究证明，在RNA聚合酶II(RNA Polymerase II, Pol II)启动子驱动下表达的miRNA比shRNA更适合用于中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO)细胞中α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)的敲减。在引入靶向FUT8 mRNA的miRNA后，重组单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb)Asn297(EU编号)位N-糖链岩藻糖化水平显著降低(亲水相互作用液相色谱-高效液相色谱法HILIC-HPLC检测>90%岩藻糖缺失；完整质谱未检出岩藻糖化产物)，且对mAb表达量无显著影响。相比之下，过表达靶向FUT8 mRNA的shRNA会导致mAb残留岩藻糖化水平较高，并使mAb滴度(titer)大幅下降。miRNA克服了shRNA敲减方法的局限性，使其成为生物制药生产中制备岩藻糖缺失抗体的有力工具。

论文解读：CHO细胞中miRNA与shRNA敲减FUT8制备岩藻糖缺失抗体的比较研究

本文发表于《mAbs》，研究背景如下：IgG1型单克隆抗体(mAb)的Fc段N-糖链核心岩藻糖化由α1,6-岩藻糖基转移酶(FUT8)催化，岩藻糖缺失(afucosylation)可显著增强Fc段与FcγRIIIa的结合亲和力，从而提升抗体依赖的细胞介导的细胞毒性(ADCC)效应，这对肿瘤治疗性抗体至关重要。目前获得岩藻糖缺失抗体的主流方法包括FUT8或GDP-岩藻糖4,6-脱水酶(GMD)基因敲除宿主细胞、添加岩藻糖类似物抑制剂、共表达原核还原酶(RMD)或抗FUT8胞内抗体(intrabody)。但这些方法分别存在需重建生产工艺平台及许可费用高、抑制剂安全性与成本问题、或需复杂筛选等局限。利用shRNA或人工设计miRNA敲减FUT8/GMD基因无需更换宿主细胞系，操作简便灵活，但传统shRNA过表达易引起RNA干扰(RNAi)通路饱和导致细胞毒性及产量下降，且岩藻糖缺失效率有限。因此，研究人员旨在系统比较shRNA与Pol II启动子驱动的miR30骨架miRNA在稳定产抗体CHO细胞池中对FUT8敲减效果及其对抗体的岩藻糖化水平和表达滴度的影响，评估其作为生物制药工艺工具的适用性。

研究人员以商品化CHO GS敲除宿主细胞系转染含mAb轻链(LC)、重链(HC)、谷氨酰胺合成酶(GS)筛选标记及shRNA或miRNA表达框的多基因载体，建立稳定转染细胞池，通过瞬转初筛及摇瓶 fed-batch 培养，利用亲水相互作用液相色谱-高效液相色谱(HILIC-HPLC)分析N-糖谱、Octet检测mAb滴度、完整质谱(intact mass spectrometry)确认糖型，比较不同构建体效果。主要关键技术方法为：以稳定转染建立共表达两种IgG1型重组mAb(mAb1、mAb2)及FUT8/GMD敲减元件的CHO细胞池；测试Pol III(U6、tRNA^Val)启动子驱动的多种串联shRNA(tandem shRNA)构建体及Pol II(人泛素C启动子UBC、小鼠巨细胞病毒启动子mCMV、2G UNic?启动子)驱动的miR30-scaffold miRNA(miRNA-Fut8-1/2)构建体；通过HILIC-HPLC定量岩藻糖缺失率，Octet测定mAb滴度，完整质谱验证糖型结构。

Short communication（研究结果）

研究人员首先构建了含FUT8与GMD靶向shRNA的串联表达框(Tandem 1–4)，瞬转筛选发现Tandem 1(含tRNA^Val启动子驱动抗FUT8 shRNA- tRNA融合序列及U6启动子驱动抗GMD shRNA)对mAb1可达>50%岩藻糖缺失且滴度影响最小。建立稳定池后发现：单独Tandem 1使mAb1岩藻糖缺失率达~80%、mAb2达~50%，联合其他串联构建体则明显降低滴度；增加Tandem 1拷贝数或仅保留FUT8靶向shRNA不能进一步提高岩藻糖缺失率。表明shRNA敲减存在平台期且对高产mAb2细胞岩藻糖缺失更难实现，同时shRNA过表达普遍伴随滴度下降风险。

随后研究人员将有效shRNA序列克隆至miR30骨架，测试U6启动子驱动、与轻链mRNA融合表达及Pol II启动子(UBC、mCMV、2G UNic?)直接驱动三种方式。结果发现：U6启动子及LC融合法未能有效敲减FUT8且降低mAb2滴度；而Pol II启动子驱动的miR30-miRNA可使岩藻糖缺失率>95%(最强为2G UNic?启动子)，HILIC-HPLC显示FA2向A2、FA2G1向A2G1完全转化，完整质谱未检出残留岩藻糖化糖型，且无异常糖基化或翻译后修饰，mAb滴度与对照无显著差异。证明Pol II启动子驱动的miRNA敲减既能高效去岩藻糖化又不影响抗体产量。

讨论与结论总结（翻译并浓缩）

研究表明，基于miR30骨架、由Pol II启动子驱动的FUT8靶向miRNA表达框可整合入常规抗体表达载体，在稳定CHO细胞池中实现>95%抗体岩藻糖缺失且不损害mAb表达量，无需预选宿主细胞或添加抑制剂。残留岩藻糖化(<5%)因单个Fc岩藻糖缺失已足够增强ADCC，实际不影响活性，可通过单侧质量标准控制。相较之下，shRNA敲减因可能饱和内源性RNAi(Dicer)通路干扰细胞生理过程，导致残留岩藻糖化偏高及抗体滴度降低。miRNA经内源microRNA加工途径，不造成RNAi负荷过载且引导链选择更准确、脱靶少。因此，Pol II启动子驱动的miRNA是优于shRNA的FUT8敲减工具，为生物制药中灵活调控抗体岩藻糖化质量属性提供了可靠策略。