《mAbs》：Development of single-chain C1q affinity chromatography–mass spectrometry for the glycoform-resolved characterization of low-affinity immunoglobulin G interactions
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补体因子C1q与免疫球蛋白G（IgG）抗体Fc区（可结晶片段）的相互作用受Asn297位点保守IgG糖基化位点的调控，是补体依赖性细胞毒性（CDC）的关键决定因素。然而，表征这种弱单价相互作用具有挑战性，因为标准结合实验无法解析抗体蛋白质型（proteofor
补体因子C1q与免疫球蛋白G（IgG）抗体Fc区（可结晶片段）的相互作用受Asn297位点保守IgG糖基化位点的调控，是补体依赖性细胞毒性（CDC）的关键决定因素。然而，表征这种弱单价相互作用具有挑战性，因为标准结合实验无法解析抗体蛋白质型（proteoform）的内在异质性，除非进行特异性工程改造或富集。本研究开发了一种单链C1q亲和色谱–质谱联用（scC1q AC–MS）方法以解析IgG糖型。分析低亲和力相互作用的主要障碍是固定相的非特异性结合（NSB）。通过挥发性盐的系统筛选，研究人员鉴定出碳酸氢铵作为合适的流动相，与标准乙酸铵或甲酸铵溶剂以及先前建立的非挥发性缓冲液相比，显著降低了NSB。优化后的方法成功重现了已建立的人IgG亚类亲和力层级（IgG3 > IgG1 ? IgG2 > IgG4）。此外，高分辨MS检测实现了单个糖型的分离，证实了高甘露糖聚糖显著降低C1q亲和力，而半乳糖化则提供适度增强。该开发方法的新颖性在于将scC1q AC推进为MS兼容平台，消除了繁琐糖工程化的需要，直接提供异质抗体蛋白质型混合物中单个糖型的同时结合读数。通过实现独立于糖基化变异性的内在抗体亲和力的无偏比较，scC1q AC–MS为IgG抗体的开发与表征提供了有力新工具，并为弱蛋白质相互作用的色谱分析建立了蓝图。
蛋白质-蛋白质相互作用的表征是理解抗体生物学功能与治疗效力基础。低亲和力蛋白质-蛋白质相互作用（解离常数K
D > 10 μM）的评估尤为困难，常规分析手段如表面等离子体共振（SPR）受限于快速动力学、溶解度及质量传递等问题。亲和色谱（AC）是研究低亲和力相互作用的强大技术，其主要优势在于与在线质谱（MS）的直接兼容性，后者可提供蛋白质型分辨率，从而揭示抗体的内在异质性。然而，开发适用于低亲和力相互作用的AC–MS方法高度依赖于降低非特异性结合（NSB）；与固定相的次级相互作用可能导致峰展宽或保留时间偏移，掩盖特异性亲和力的细微差异并影响实验表现。因此，系统理解影响NSB的因素对于成功的AC–MS方法开发至关重要。
C1q与IgG可结晶片段（Fc）的相互作用是经典补体通路激活的关键第一步，对抗体效应功能评估至关重要。对于依赖CDC发挥作用的治疗性单克隆抗体（mAb），如抗CD20或抗CD38的IgG1类疗法，精确评估C1q结合的工具是识别关键质量属性（CQA）所必需的。C1q相互作用具有低单价IgG亲和力特征，解离常数通常处于高微摩尔至低毫摩尔范围。尽管该通路在体内的功能相关性由多价亲合力驱动，但研究单价C1q–IgG相互作用的相关性已获得认可，它提供了简化的结合读数，用于比较IgG亚类或变体，而无须考虑协同效应带来的混杂影响。既往研究采用生物层干涉测量、酶联免疫吸附测定（ELISA）和SPR对人IgG亚类、Fc工程改造及Fc糖基化等多种修饰的C1q结合潜力进行排序表征，但此类弱、瞬时相互作用的表征在技术上仍具挑战性。传统生物传感器常需专用高密度表面以产生足够信噪比，这可能引入质量传递假象，并对异质样品中细微差异的分辨造成困难。单链人C1q（scC1q）的AC应用曾被报道为替代方案，但现有检测仅提供紫外（UV）读数（非MS兼容流动相），且所选条件表现出高度NSB。为将AC平台进一步推进为稳健的蛋白质型分辨实验，MS兼容性与NSB缓解是必需的。
本研究报道了一种新型AC–MS分析方法的开发，用于分析单价scC1q–IgG相互作用。研究人员系统优化了流动相组成，以最大化特异性scC1q结合同时降低NSB。该优化涵盖了对MS兼容挥发性缓冲液系统（乙酸铵、甲酸铵和碳酸氢铵）在多种离子强度和pH值范围内的全面比较。为确保平台的广泛适用性，研究采用了八株具有不同scC1q结合倾向和NSB倾向的单克隆抗体。方法性能进一步针对一株IgG1单克隆抗体的线性、回收率和进样重复性进行评估。最终，所开发的实验应用于四个IgG亚类（1–4）相互作用以糖型分辨方式的研究，证明了该平台解析异质抗体蛋白质型混合物中亲和力细微差异的能力。
**关键方法技术**
本研究构建并使用了基于scC1q的亲和色谱柱。scC1q构建体（含C端AviTag标签）表达于人胚肾293（HEK293）细胞，经体外生物素化后固定于链霉亲和素琼脂糖凝胶高性能微珠上，装填至Tricorn柱壳中。研究采用Vanquish Horizon超高效液相色谱（UHPLC）与Q Exactive UHMR Orbitrap质谱仪联用系统。流动相A为MS级水，流动相B为150 mM挥发性铵盐（乙酸铵、甲酸铵或碳酸氢铵）。优化后的AC方法采用初始等度保持（50 mM铵盐，5分钟），随后线性盐梯度升至150 mM（15分钟），最后重新平衡至初始条件（10分钟）。最终优化的AC–MS条件采用150 mM碳酸氢铵（未调pH 7.8）作为流动相B。MS以正离子模式采集，质荷比范围2000–25000，分辨率设为25000（m/z 400处）。为有效脱溶剂化，施加?100 V的源内捕获电压。MS数据分析包括谱图去卷积和质量归属，采用Byosphere软件；UV峰面积和保留时间采用FreeStyle软件提取；提取离子流色谱图（XIC）基于理论m/z值在100 ppm窗口内生成。
**研究结果**
**挥发性盐的选择是scC1q AC–MS最关键的因素**
流动相优化聚焦于最大化特异性scC1q–抗体相互作用同时降低与琼脂糖–链霉亲和素基质的NSB。研究使用八株单克隆抗体进行筛选，包括人IgG亚类（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）、不同互补性决定区（CDR）的变体（A、B和C）以及Fc氨基酸替换（PGLALA变体，消除C1q结合）。IgG-B和IgG-C抗体骨架均携带鼠源轻链，作为方法开发的关键基准。主要考察变量为MS兼容铵盐类型、离子强度和pH。结果发现，挥发性铵盐的选择是空白（非功能化）柱上NSB影响最显著的因素。在初始浓度50 mM条件下，碳酸氢铵在所有测试单克隆抗体中产生最低的NSB。然而，IgG-C骨架最易发生NSB，在乙酸铵和甲酸铵存在下表现出与空白柱的显著相互作用。将流动相调整至pH 7.4可降低乙酸铵和甲酸铵的NSB，但碳酸氢铵仍保持最优缓冲效果，维持最低总体NSB。降低离子强度通常与增加的特异性结合亲和力相关，但也引入了样品间NSB的更大变异性。最终结合亲和力排序确定如下：IgG1-B PGLALA = IgG1-C PGLALA < IgG4-C < IgG2-C < IgG1-A = IgG1-B < IgG1-C < IgG3-C。基于此，50 mM碳酸氢铵（未调pH）被选为scC1q AC–MS最适宜流动相。
**scC1q AC–MS关键方法特性的评估**
以最具NSB挑战性的IgG1-C骨架评估方法的分析性能，包括线性、回收率、进样重复性、MS响应和特异性。方法表现出优异的线性，UV峰面积在2.5 μg至7.5 μg质量负载范围内呈比例响应，且保留时间稳定，表明无柱过载。基于峰面积的定量回收率持续保持高位（94%–108%）。六针连续进样的重复性评估显示一致的UV色谱图和稳定的保留时间（5.3 ± 0.1分钟）。主要糖型XIC保留时间的标准偏差范围为±0.2分钟（最丰富糖型G0F/G0F）至±0.3分钟（低丰度糖型如G1F/G2F）。MS基峰色谱图和电喷雾电流用于监测进入MS源的流动相组成，确认了从50 mM到150 mM碳酸氢铵的梯度转变线性。代表性质谱信号显示26+至32+的电荷态分布，为IgG1-C主要糖型的解析提供足够分辨率。方法特异性通过IgG-C亚类1–4及IgG1-C PGLALA变体的洗脱顺序证实：IgG1-C PGLALA < IgG4-C < IgG2-C < IgG1-C < IgG3-C，与IgG–C1q相互作用的先验知识一致。
**利用scC1q AC–MS解析单克隆抗体糖型的相对结合**
最后，评估了C1q AC–MS分离单个糖型的能力，涵盖四个IgG-C亚类。scC1q AC–MS揭示了IgG变体的部分分离，实现了糖型特异性结合行为的直接比较。IgG3-C表现出最强亲和力，在线性盐梯度内以最高保留时间洗脱，其次为IgG1-C。较弱结合者IgG2-C和IgG4-C在初始等度相洗脱，其中IgG2-C相比IgG4-C表现出更强的结合，体现为稍晚保留时间和增加的峰宽。糖基化模式亦影响结合行为，但该效应具有亚类依赖性。对于强结合者（IgG1-C和IgG3-C），半乳糖化水平增加与保留时间向更高值轻微偏移相关。然而，该偏移在弱结合者（IgG2-C和IgG4-C）中未观察到。相反，高甘露糖物种（M5/M5）在所有四个亚类中均一致地比复合型糖型更早洗脱，表明C1q亲和力降低。此外，对IgG3-C G0F/G0F变体中单个O-聚糖（H1N1S2）的评估显示，与无O-聚糖的G0F/G0F糖型相比无可见保留偏移。
**结果讨论**
**流动相选择对AC–MS低亲和力相互作用研究的重要性**
AC在研究弱亲和力相互作用（K
D在μM范围）方面具有独特优势，如单价scC1q–IgG相互作用。虽然SPR已成功用于确定IgG–C1q结合亲和力，但其固有地提供异质抗体群体的平均结合常数。相比之下，AC–MS具有解析特定蛋白质型结合行为的独特能力，否则这些行为在标准SPR实验中被平均化。然而，从批量结合实验向高分辨AC–MS的过渡，关键依赖于流动相优化以最大化特异性保留同时抑制NSB。Marshall等先前报道了C1q AC–UV中NSB的挑战，其工作建立了scC1q AC格式的可行性，但使用了非挥发性缓冲液且无在线MS联用选项，且受限于与柱基质显著NSB，这对因抗体变体在空白柱上保留差异巨大而排序抗体结合能力造成挑战。本研究通过系统筛选挥发性、MS兼容流动相条件，专门缓解此背景，推进了该方法学。
研究鉴定出铵盐选择是降低NSB最具影响力的因素。虽然先前AC–MS研究常成功使用乙酸铵（如Fc?RIIIb AC–MS的30 mM），但本研究数据表明这些条件对某些抗体骨架（如IgG-C）导致高背景。相反，碳酸氢铵展现出优越性能，在所有测试变体中产生最低NSB，且不受流动相pH影响。这一pH的较小影响与Roumenina等先前研究显示的IgG1–C1q相互作用广泛pH稳定性一致。但对于C1q的其他生物学相关相互作用伙伴，如C反应蛋白，pH优化可能更为重要。此外，离子强度被确认为关键调节因子。降低离子强度（30–40 mM）通常增加特异性结合，但可能无意中放大NSB，具体取决于抗体骨架。IgG-B/C骨架高度倾向于NSB，而IgG-A始终表现低NSB，突显了在方法开发中使用多样化抗体组合和阴性对照（PGLALA）的重要性。基于序列属性的分析显示，标准一维序列衍生指标如理论等电点（pI）和全局疏水性（GRAVY）评分未能预测非特异性柱相互作用。具有相同理论pI的骨架（如IgG1-A和IgG2-C）在空白柱上表现出截然不同的保留特征，且全局疏水性与NSB无相关性。这表明低亲和力scC1q AC–MS中的NSB主要由局部空间位点而非整体序列性质驱动，进而突显了AC–MS中流动相优化以广泛缓解NSB的重要性。成功缓解IgG-B/C骨架的NSB证明了所开发scC1q AC–MS平台的广泛适用性，确保即使对于具有挑战性可开发性特征或非优化可变域的治疗候选物也能进行稳健表征。
**糖型分辨结合读数的洞见**
Fc连接N-糖基化是IgG效应功能包括C1q结合及后续补体激活的已确立调节因子。本研究scC1q AC–MS分析揭示了IgG1和IgG3亚类中半乳糖化糖型的结合亲和力适度增强，体现为保留时间向更高值轻微偏移。这一观察与先前研究一致，显示末端半乳糖残基增加IgG1和IgG3的C1q结合亲和力，从而提高效力。相反，高甘露糖糖型（M5/M5）表现出保留时间最大幅度的降低，在所有四个IgFc亚类中均一致早于复合型糖型洗脱。这一发现证实了早期研究，即高甘露糖物种降低C1q亲和力进而降低CDC活性。此外，AC–MS平台的高分辨率实现了对IgG3延伸铰链区O-糖基化的独特评估，显示对保留时间无可见影响。
传统上，定义糖基化相关CQA是高度繁琐且耗时的过程。经典工作流程需要酶学重塑、制备性分级分离或特定糖型的选择性富集，随后进行广泛的结构验证。这些分离的变体再经受常受限于精度有限、亲合力假象和高实验变异性的常规批量结合或细胞基础实验。相比之下，本研究scC1q AC–MS平台将功能分离与结构鉴定统一为简化的工作流程，规避了制备性分级分离的需要。
scC1q AC–MS的适用性超越糖基化变体的表征；预计其将作为直接比较不同单克隆抗体骨架及其他翻译后修饰（PTM）或其组合（蛋白质型）的稳健工具。标准批量实验（如SPR或ELISA）产生代表整个异质群体加权平均值的单一结合值。例如，若两批单克隆抗体的糖基化特征不同（如一批具有更高高甘露糖含量），批量测量可能错误地提示骨架亲和力差异。scC1q AC–MS通过允许提取和比较相同样品中相同糖型（如直接比较G0F/G0F与M5/M5）消除了这种偏倚。本研究成功展示了跨四个人IgG亚类（IgG1–IgG4）的这一能力，证明了该方法的广泛适用性。
**表征单价IgG–C1q相互作用的相关性**
补体级联的生理激活由靶点上IgG寡聚化直至六聚体及与C1复合物的多价结合驱动。虽然寡聚化对高亲合力结合和强效CDC至关重要，但基本的热力学驱动因素仍是单个C1q球状头部与单个IgG Fc域之间的内在单价亲和力。该内在亲和力的变化直接影响补体激活的阈值。
为严格评估单价亲和力，研究使用了涵盖球状头部结构域hC1q A、B和C的重组scC1q配体。选择scC1q而非天然C1q是出于分析标准化的需要。天然C1q是结构复杂的六聚体组装体，涉及非共价相互作用，易于出现潜在的批间异质性和稳定性问题。通过采用工程化scC1q构建体，确保了均一、分子定义明确的固定相。这消除了配体来源的变异性，确保观察到的保留时间差异完全归因于抗体变体。研究成功重现了已建立的人IgG亚类与C1q结合的层级（IgG3 > IgG1 > IgG2 > IgG4），证实scC1q AC–MS为低亲和力相互作用的比较分析提供了精确工具，能够解析Fc中特定结构修饰（如IgG亚类或糖型）如何精细调节抗体单体的C1q亲和力。
**研究结论**
总之，本研究引入scC1q AC–MS作为新型分析工具，以扩展和简化IgG蛋白质型及其与单体状态下人scC1q结合能力的功能和结构表征。研究首次报道了专门针对此类弱生物相互作用优化的稳健MS兼容AC方法。与批量结合实验相比，该方法基于功能相关的相互作用分离单个蛋白质型，从而减少定义与C1q结合和CDC相关有意义的CQA时的不确定性。鉴于研究证实了该实验对所有IgG重链亚类和不同IgG骨架的适用性，预期该方法可在治疗-digit治疗开发和基础免疫学研究中广泛应用。研究人员认为所开发的方法简化了Fc工程化IgG单克隆抗体的开发，并作为通过AC–MS分析低亲和力蛋白质相互作用和识别CQA的重要蓝图。
