脊髓横断抑制外周神经切断后远端残端的瓦勒变性(Wallerian degeneration)及新生血管生成(neoangiogenesis)：施万细胞(Schwann cells) miR-134-5p 的参与作用

《IBRO Neuroscience Reports》：Spinal cord transverse section hinders Wallerian degeneration and neoangiogenesis after peripheral nerve transection: Involvement of Schwann cells' miR-134-5p

　　

摘要：脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）患者瘫痪肢体常发生慢性创面，提示神经调节和外周神经完整性对组织修复的重要性；然而，伴随性SCI如何改变外周神经损伤（peripheral nerve injury, PNI）后的远端反应及相关microRNA（miRNA）谱尚不清楚。研究人员采用Sprague–Dawley大鼠建立单纯坐骨神经切断模型（PNI组）及L1–L2节段完全脊髓横断联合坐骨神经切断模型（SCI+PNI组），于术后0、3、7天取材远端坐骨神经残端，行大体观察、H&E及甲苯胺蓝(toluidine blue)染色、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, MBP)免疫荧光、透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)及CD31免疫组化，评估瓦勒变性(Wallerian degeneration)与血管生成；采用small RNA测序分析miRNA表达谱并以RT–qPCR验证；通过miR?134?5p mimics/inhibitors转染大鼠施万细胞(Schwann cell)，经Transwell迁移、划痕(wound?scratch)及CCK?8增殖实验评价其功能。结果显示：PNI组远端残端明显水肿、纤维结构破坏、髓鞘快速崩解、CD31+血管环显著增多；与PNI组相比，SCI+PNI组水肿及结构破坏较轻，完整髓鞘环较多，第3、7天MBP信号更强，CD31+面积明显减小，表明瓦勒变性延迟、血管生成减少。small RNA测序鉴定多个差异表达miRNA，其中miR?134?5p和miR?142?5p在SCI+PNI组显著下调并经RT?qPCR证实；功能实验显示miR?134?5p过表达增强施万细胞迁移和增殖，抑制则产生相反效应。研究表明SCI通过延迟髓鞘清除、削弱血管生成及下调促修复miRNA（如miR?134?5p）减弱PNI诱发的远端神经反应，提示靶向miRNA介导的施万细胞调控或为改善SCI平面以下外周神经及创面修复的新策略。

论文解读：《Spinal cord transverse section hinders Wallerian degeneration and neoangiogenesis after peripheral nerve transection: Involvement of Schwann cells' miR?134?5p》发表于《IBRO Neuroscience Reports》

一、研究背景与立题依据

脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）患者瘫痪肢体极易形成慢性难愈创面，已有证据表明感觉与自主神经纤维释放的神经肽及神经递质可调控炎症、血管生成及细胞行为，提示外周神经完整性对组织修复至关重要。外周神经具备较强的内在再生能力，损伤后远端残端会发生顺行性瓦勒变性（Wallerian degeneration, WD）——包括髓鞘崩解、巨噬细胞招募、施万细胞（Schwann cell, SC）去分化与增殖及微血管重塑，共同营造利于轴突再生的微环境，其中修复表型施万细胞起核心作用。然而，绝大多数瓦勒变性与施万细胞生物学研究均在神经系统完整动物中进行，SCI所致中枢传入中断及自主神经失衡、免疫功能障碍是否会重塑外周神经对损伤的远端反应尚不明确。微小RNA（microRNA, miRNA）是外周神经系统中重要的转录后调控因子，可在PNI后动态调节施万细胞的髓鞘自噬（myelinophagy）、增殖迁移及血管新生，但SCI背景下外周神经远端残端miRNA谱及其对施万细胞功能的调控作用鲜有报道。本研究通过建立单纯外周神经切断（PNI）与SCI合并PNI（SCI＋PNI）的大鼠平行模型，探讨SCI对远端坐骨神经残端瓦勒变性、新生血管生成及miRNA表达的影响，并验证候选miR?134?5p对施万细胞功能的作用。

二、主要关键技术方法

研究人员将54只雄性Sprague–Dawley（SD）大鼠随机分为PNI组（单纯单侧坐骨神经切断）与SCI＋PNI组（L1–L2完全脊髓横断联合坐骨神经切断），于术后0、3、7天取远端坐骨神经残端（n＝9/组/时间点）。主要技术手段包括：大体形态学观察；石蜡切片H&E及甲苯胺蓝（toluidine blue）染色定量完整髓鞘环；髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein, MBP）免疫荧光及透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）评估髓鞘崩解与清除；CD31免疫组化标记血管内皮细胞并定量CD31⁺面积及血管环数目以评估新生血管生成（neoangiogenesis）；small RNA测序筛选差异表达miRNA并结合RT–qPCR验证；体外分离培养大鼠施万细胞（RSC, ATCC CRL?2765），转染miR?134?5p mimic/inhibitor及相应对照，通过Transwell小室迁移实验、划痕愈合（scratch?wound）实验及CCK?8法分别检测施万细胞迁移与增殖能力。统计分析采用单因素方差分析及事后检验，p＜0.05为差异显著。

三、研究结果

3.1. SCI is associate with a post?PNI blunted responses in the distal sciatic stump（SCI与PNI后远端坐骨神经残端反应迟钝相关）

PNI组术后3、7天远端残端出现明显水肿及纤维结构紊乱，而SCI＋PNI组未见明显水肿，仅轻度软化，H&E染色示纤维排列较有序。结果表明单纯PNI可诱发典型的急性损伤反应，SCI合并PNI使该反应被钝化、延迟。

3.2. SCI is associated with delayed Wallerian degeneration of the sciatic nerve in rats（SCI与大鼠坐骨神经瓦勒变性延迟相关）

甲苯胺蓝染色示SCI＋PNI组第3、7天完整髓鞘环数显著多于PNI组（p＜0.01～0.001）；MBP免疫荧光强度在SCI＋PNI组更高（p＜0.001），提示髓鞘清除效率更低；TEM显示PNI组髓鞘板层分离、空泡化并崩解为碎屑，SCI＋PNI组仅见轻度变形与板层略松。证实SCI使远端残端髓鞘崩解与清除明显延迟，瓦勒变性受抑。

3.3. SCI is associated with reduced angiogenesis in post?PNI nerve stumps（SCI与PNI后神经残端血管生成减少相关）

CD31⁺面积与血管环计数在第3、7天PNI组均显著高于SCI＋PNI组（p＜0.05～0.01）。表明单纯PNI诱导活跃的早期间质新生血管生成，SCI使其明显减弱。

3.4. Small RNA sequencing reveals significant downregulation of miR?134?5p and miR?142?5p in the SCI＋PNI group（small RNA测序显示SCI＋PNI组miR?134?5p和miR?142?5p显著下调）

术后第3天筛选到30个差异表达miRNA，其中SCI＋PNI组下调13个（含miR?134?5p、miR?142?5p）；RT–qPCR验证二者在SCI＋PNI组表达显著低于PNI组（miR?134?5p：p＝0.0262；miR?142?5p：p＝0.0045）。预测靶基因富集于溶酶体、轴突导向（axon guidance）、鞘脂代谢及PI3K–Akt信号通路等，与髓鞘清除及施万细胞可塑性密切相关。

3.5. miR?134?5p promotes rat Schwann cell migration and proliferation in vitro（miR?134?5p促进大鼠施万细胞体外迁移与增殖）

Transwell实验中miR?134?5p mimic组迁移细胞数显著多于对照组及inhibitor组（p＜0.001）；划痕实验示mimic组成团迁移加快（剩余划痕面积更小，p＜0.001），inhibitor组迁移受抑（p＜0.001）；CCK?8示mimic组OD₄₅₀值在24 h、36 h显著高于对照组（p＜0.05～0.001）。表明miR?134?5p过表达增强施万细胞迁移与增殖，抑制则削弱之，支持其为施万细胞介导神经修复的正向调控因子。

四、讨论与结论总结

本研究通过平行大鼠模型证明，SCI合并PNI使远端坐骨神经残端急性期反应钝化，瓦勒变性启动延迟且髓鞘清除受阻，局部新生血管生成显著减弱；伴随特异性miRNA谱改变，其中miR?134?5p与miR?142?5p在SCI＋PNI组明显下调，体外实验证实miR?134?5p可促进施万细胞迁移与增殖——此二者为修复表型施万细胞行使髓鞘碎片清除及Büngner带形成所必需的功能。SCI引起的全身免疫失调、自主神经失衡及局部施万细胞表型转换障碍可能是上述改变的潜在机制。这些发现说明SCI并非仅截断上位中枢输入，而是从根本上重塑了平面以下外周神经对损伤的反应能力，形成不利于再生的微环境，部分通过下调促修复miRNA（如miR?134?5p）实现。尽管未追踪远期功能恢复且未在体操纵miRNA，本研究首次在体内关联SCI背景下外周神经远端瓦勒变性、血管新生与miRNA介导的施万细胞调控，为阐明SCI平面以下组织修复不良提供了外周神经层面的解释，并提示以miRNA–施万细胞轴为靶点的干预策略有望改善SCI患者外周神经及并发慢性创面的修复。

研究结论翻译：

本研究表明SCI通过延迟髓鞘清除、损害血管生成及下调包括miR?134?5p在内的促修复miRNA，削弱PNI诱发的远端外周神经反应，提示靶向miRNA介导的施万细胞调控可为改善SCI平面以下外周神经及创面修复提供新策略。