小脑颗粒细胞对分子分型苔状纤维输入的结构化采样

《Frontiers in Computational Neuroscience》：Structured sampling of molecularly classified mossy fiber inputs by cerebellar granule cells

　　

小脑颗粒细胞层接收来自不同脑区的苔状纤维(mossy fiber, MF)输入，但单个颗粒细胞(granule cell, GC)如何采样不同类型输入的规则尚不清楚。研究人员利用来自成年雌性小鼠小脑的体积相关光镜和电镜(volumetric correlated light and electron microscopy, vCLEM)数据集，其中VGluT1阳性和VGluT1阴性苔状纤维末梢通过分子标记加以区分，重建了颗粒细胞与苔状纤维的连接关系以研究输入选择规则。为验证连接是否可由空间邻近性单独解释，研究人员基于经验性细胞空间排布开发了距离受限随机采样零模型，模拟成年和发育期采样模式。以颗粒细胞为中心的分析显示，颗粒细胞从同一苔状纤维获得的共同支配低于随机预期，表明结构化采样无法仅由距离约束的随机连接解释。此外，颗粒细胞亚群优先采样VGluT1阳性或VGluT1阴性苔状纤维。相比之下，以苔状纤维为中心的分析表明，单个末梢向颗粒细胞的输出分布大致符合随机采样，但成年模型中的采样比反映发育过程的模型更具选择性。该研究揭示了小脑VGluT1阳性和VGluT1阴性苔状纤维输入的结构化非随机采样特征，为颗粒细胞如何整合分子差异输入以支持小脑计算提供了新见解。

小脑颗粒细胞层是脑内神经元 packing 密度最高的结构，也是小脑皮层突触整合的第一站。颗粒细胞接收来自外源性苔状纤维的输入，这些轴突起源于脑桥核、前庭核、网状结构和脊髓等多个脑区，传递感觉、运动和状态相关信息。此外，内在性苔状纤维末梢来自小脑前庭区的单极刷状细胞(unipolar brush cell, UBC)。这些异质性输入的汇聚使颗粒细胞能够扩展和转换传入信号，构成小脑计算（包括时序、预测和学习）的基础。基于Marr-Albus理论，颗粒细胞被认为以随机、非结构化的方式采样苔状纤维以增强模式分离。然而，近年来连接组学(connectomics)研究利用体积电子显微镜(volumetric electron microscopy, vEM)技术对神经环路进行精细重建，发现颗粒细胞输入采样并非完全随机：单个颗粒细胞比解剖学约束的随机模型预期更频繁地共享苔状纤维输入，且苔状纤维末梢在颗粒细胞间呈不均匀分布。这些发现与稀疏结构化突触连接可优化类小脑回路（包括颗粒细胞网络）模式分离和维度扩展的理论预测一致。

尽管该层的解剖学组织已被充分表征，但单个颗粒细胞如何从不同分子型苔状纤维采样的原则仍 largely unknown。苔状纤维不仅在解剖起源上存在差异，在分子身份上也存在区别。囊泡谷氨酸转运体(vescular glutamate transporter, VGluT)的表达可区分苔状纤维类别：许多小脑前神经元（包括外侧网状核神经元）共表达VGluT1和VGluT2并投射至颗粒细胞。在小脑蚓部，苔状纤维末梢显示异质性VGluT表达，脊髓小脑纤维和背柱纤维分别偏好表达VGluT2和VGluT1，形成颗粒细胞层内互补的 parasagittal 带。在小鼠前庭小脑，来自钙结合蛋白(calretinin)阳性UBCs的苔状纤维末梢为VGluT1和VGluT2双阳性，而来自mGluR1α阳性UBCs的末梢仅VGluT1阳性。这种分子多样性提示颗粒细胞接收的输入具有不同的生理学特性和潜在的功能角色差异，但颗粒细胞是通过结构化还是随机采样来整合这些分子差异的苔状纤维类型仍不清楚。

研究人员利用已发表的成年小鼠小脑vCLEM数据集（Han et al., 2024），其中VGluT1阳性和VGluT1阴性苔状纤维末梢通过免疫标记区分，重建了颗粒细胞及其苔状纤维输入，并开发了空间约束零模型以模拟不同解剖约束下的输入采样。为同时捕捉成熟连接和颗粒细胞输入结构的潜在发育起源，研究人员建模了两种空间模式：第一种反映成年空间约束，基于颗粒细胞的平均树突伸展距离；第二种代表发育过程中树突空间伸展机会的上限 permissive 边界，使用最大树突伸展距离。该permissive upper-bound模型的动机来自颗粒细胞发育的几个特征：体内成像显示早期 postnatal 阶段（P11-P23）颗粒细胞 transiently 表现 supernumerary 未成熟树突过程，随后修剪为稳定的爪状树突；群体水平分析显示P10-P118期间总体树突延展性 generally comparable，但早期发育阶段部分颗粒细胞表现略广的伸展。同时，苔状纤维在大多数颗粒细胞完成从外颗粒层向下迁移及树突成熟之前即已进入内颗粒层。这些过程意味着颗粒细胞可能探索比成年电路最终保留的更大空间领域，遇到更广泛的潜在苔状纤维末梢伙伴。因此，permissive upper-bound模型并非作为发育树突伸展的字面表征，而是作为反映发育过程的敏感性分析。

研究结果部分，研究人员首先对颗粒细胞层的分子和细胞特征进行了分析。在已发表的成年雌性小鼠小脑（半球Crus I区）vCLEM数据集中，VGluT1阳性苔状纤维末梢显著更丰富，且表现出更高的突触小泡密度和体积。在数据集中间平面共重建382个细胞，其中364个为颗粒细胞，其余包括星形胶质细胞、少突胶质细胞、篮细胞、1个浦肯野细胞和1个身份不明细胞。其中53个颗粒细胞的树突爪完全终止于图像体积内的苔状纤维膨体，这些细胞与166个苔状纤维末梢（109个VGluT1阳性，57个VGluT1阴性）形成突触。每个颗粒细胞平均接触4.00±0.65个苔范纤维末梢，每个苔状纤维末梢平均接触1.28±0.52个颗粒细胞。VGluT1阳性与VGluT1阴性末梢的树突伸展距离无显著差异（Welch's t-test, p=0.22）。

以颗粒细胞为中心的分析揭示苔状纤维输入的结构化采样。研究人员构建了两个以每个颗粒细胞为中心的空间约束零模型：成年模型（半径=平均树突伸展17.62 μm）和permissive upper-bound模型（半径=最大树突伸展40.08 μm），各运行1,000次蒙特卡洛模拟。结果显示，真实数据集中共享至少一个苔状纤维伙伴的颗粒细胞对数量显著低于成年模型和permissive upper-bound模型（成年模型：p-value (real
当将苔状纤维分为VGluT1阳性和VGluT1阴性两类时，真实数据集的共享伙伴数量在两类中均显著低于两种模型（VGluT1阳性：成年模型Cohen's d=-12.711，permissive模型d=-12.140；VGluT1阴性：成年模型d=-26.482，permissive模型d=-21.476），且VGluT1阴性末梢的偏离更强，支持颗粒细胞可能对较稀疏输入类型采用更有效采样策略的假说。此外，与成年零模型相比，真实数据集显示VGluT1阳性输入偏好的颗粒细胞过 represented，同时存在较小群体偏向VGluT1阴性输入（VGluT1阳性比例：Mann-Whitney U test, U=1757.5, p=0.026；VGluT1阴性比例：U=1065.5, p=0.032）。基于成年零模型，研究人员量化了每个颗粒细胞VGluT1阳性输入比例的百分位秩，超过90th百分位的 classified 为VGluT1阳性偏好型，同理识别VGluT1阴性偏好型。值得注意的是，VGluT1阳性输入偏好 top decile 的细胞一致落在VGluT1阴性偏好的 bottom decile，反之亦然，强化了结构化非随机采样亚型的存在。据此将群体分为三类：VGluT1阳性偏好型（n=11）、VGluT1阴性偏好型（n=2）和非偏好/中性型（n=40）。

以苔状纤维为中心的分析表明输出呈随机分布。研究人员采用互补的以每个苔状纤维末梢为中心的零模型方法：成年模型（半径=平均树突伸展17.62 μm）和permissive upper-bound模型（半径=最大树突伸展40.08 μm）。结果显示，经验数据中的苔状纤维对共享至少一个颗粒细胞目标的比例与成年零模型无显著差异（p-value (real
按分子身份细分分析，VGluT1阳性末梢表现与总体群体相似（成年模型p=0.396，permissive模型p<0.001），但在精化成年模型中再次显示显著偏离（p=0.032）。VGluT1阴性末梢在成年或permissive模型中表现与总体相似（成年模型p=0.413，permissive模型p=0.015），但精化成年模型产生非显著趋势（p=0.077），提示VGluT1阴性末梢比VGluT1阳性末梢表现更随机的分布，可能作为确保颗粒细胞广泛获取这些较稀疏输入的策略。进一步评估苔状纤维是否优先靶向特定颗粒细胞亚型，发现每个苔状纤维末梢接触的VGluT1阳性偏好型或VGluT1阴性偏好型颗粒细胞比例均显著高于随机预期（p=0.0000），表明苔状纤维确实偏向连接 predisposed 采样它们的颗粒细胞。然而，所有末梢（包括VGluT1阳性和VGluT1阴性亚集）的颗粒细胞目标类型多样性（定义为接触的GC偏好类型数：1、2或3）与成年零模型无显著差异，支持虽然存在一定程度的优先靶向，苔状纤维末梢 generally 采用最大化跨可用颗粒细胞分布的策略。

讨论部分，研究人员指出该发现为小脑皮层内颗粒细胞连接的结构逻辑提供了新见解，证明颗粒细胞以非随机的结构化方式采样苔状纤维输入。利用分子定义的末梢和空间约束零模型，发现颗粒细胞表现出强于随机预期的输入偏好，尤其针对该区域较不丰富的VGluT1阴性末梢，提示颗粒细胞可能通过更广泛采样较不常见输入类型来补偿输入稀疏性。

颗粒细胞中心和苔状纤维中心分析之间的对比突出了电路组织的重要不对称性：虽然颗粒细胞表现选择性采样，苔状纤维末梢的输出分布大致符合随机靶向。这种差异意味着输入选择可能更多由颗粒细胞特性（如树突伸展或发育修剪）驱动，而非苔状纤维的靶向输出。这也与发育过程中苔状纤维在颗粒细胞进入颗粒层之前即形成末梢的事实一致，提示颗粒细胞特性可能在突触伙伴选择中起主导作用。然而，这种明显不对称性应谨慎解读，因为数据集中苔状纤维末梢平均接触的颗粒细胞较少，有限的连接发散性降低了MF中心分析检测偏离随机连接的统计效力，可能掩盖苔状纤维输出模式中的潜在结构。

跨成年和permissive upper-bound空间模式的建模表明，观察到的颗粒细胞-苔状纤维连接无法仅由空间可及性解释。经验数据与两种模型均存在偏离，证明稳健的随机输入采样，与增强相邻颗粒细胞间输入多样化的修剪或竞争性突触形成机制一致。成年模型与permissive模型之间偏离幅度的差异预期取决于几何重叠，因此不作机制性解读。

当将颗粒细胞树突伸展的空间异质性纳入MF中心分析的零模型时出现有趣见解：当所有颗粒细胞在等于全局平均树突伸展的半径内采样时（成年零模型），观察到的苔状纤维末梢共享多个颗粒细胞的频率与随机空间采样无法区分；但当每个颗粒细胞被分配其经验性平均树突伸展（精化成年零模型）时，苔状纤维末梢对的颗粒细胞共享程度变得显著低于随机采样。这种差异源于树突伸展的变异性增加了不同苔状纤维末梢可及候选颗粒细胞池之间的重叠，从而在随机采样下增加了同一苔状纤维末梢对汇聚到多个颗粒细胞的概率。经验连接低于这一预测的事实表明，苔状纤维末梢并未完全采样所有空间可及的颗粒细胞，电路似乎适度限制对相同颗粒细胞对的冗余汇聚，这与颗粒细胞中心分析中观察到的模式相似。VGluT1阳性苔状纤维末梢观察到相同模式，而VGluT1阴性末梢表现类似但较弱的零预期偏离。VGluT1阴性末梢对颗粒细胞稍更随机的采样可能反映确保充分整合 underrepresented 输入流的策略。

研究结论部分指出，该分析基于已发表的小脑Crus1半球vCLEM数据集，利用CLEM将分子身份叠加于EM数据的可能性。为扩展此类分析并深化对颗粒细胞如何采样不同苔状纤维输入的理解，生成更多这种相关数据集并扩大规模将是有益的。基于染料或病毒示踪技术的荧光标记方法可用于标记来自不同区域的苔状纤维，更新的光镜连接组学方法如LICONN有助于积累更多具分子识别的连接数据。该研究建立了检验小脑微电路如何平衡输入分子多样性、空间约束和发育过程的框架，为空间约束、分子身份和发育过程如何共同塑造颗粒细胞输入采样和小脑计算提供了框架。