基于双分子荧光互补(BIFC)、稳定性分析及AlphaFold 3建立海兔Aplysia PKM与KIBRA异构体特异性相互作用模型

《Molecular Brain》：Generating models for isoform-specific PKM-KIBRA interactions with BIFC, stabilization and AlphaFold 3

　　

蛋白激酶C(PKC)截短组成型活化形式称为蛋白激酶M(PKM)，参与脊椎与无脊椎动物长时记忆维持。研究人员此前发现海兔(Aplysia)肾/脑蛋白(KIBRA)可稳定非典型PKM Apl III而非经典PKM Apl I；改变推定非典型PKM结合位点的Aplysia KIBRA无法稳定PKM Apl III并消除PKM Apl III支持的塑性。本研究在海兔神经元中检测KIBRA变异体与PKM Apl III间的双分子荧光互补(BIFC)，包括：推定非典型结合位点突变的KIBRA、可稳定PKM Apl I但不稳定PKM Apl III的可变剪接异构体，及哺乳动物WW和C2结构域含蛋白3(WWC3，脊索动物特异性KIBRA家族扩展成员)中与癌症或神经发育障碍相关的若干突变。意外发现部分KIBRA变异体与PKM Apl III显示BIFC信号却不稳定PKM Apl III。研究人员利用蛋白质–蛋白质相互作用建模(AlphaFold 3)探明BIFC与KIBRA及其变异体对PKM稳定化不一致的原因，提出稳定化关联于KIBRA对PKM的稳定抑制模型。

论文解读：基于BIFC、稳定性分析及AlphaFold 3建立海兔PKM与KIBRA异构体特异性相互作用模型

一、研究背景与立题依据

长时记忆维持依赖于突触强度的持久改变，其中截断型蛋白激酶C——蛋白激酶M(PKM, Protein Kinase M)是维持长时突触可塑性的关键持久性激酶。海兔Aplysia感觉–运动神经元突触中，由钙蛋白酶剪切产生的经典PKC衍生PKM Apl I与非典型PKC衍生PKM Apl III分别参与不同类型长时易化(LTF)的维持。肾/脑蛋白KIBRA（WWC1，Kidney/BRAin protein）作为支架蛋白，可与脊椎动物PKMζ（atypical PKCζ衍生的PKM）结合并稳定其水平；在海兔中野生型KIBRA可稳定PKM Apl III但不稳定PKM Apl I，而KIBRA_RSR?AAA（将推定PKM结合域Arg¹³¹⁷Ser¹³¹⁹Arg¹³²¹突变为Ala¹³¹⁷Ala¹³¹⁹Ala¹³²¹）丧失对PKM Apl III的稳定作用并阻断LTF，剪接变异体KIBRA_splice则可稳定PKM Apl I而不稳定PKM Apl III。然而，KIBRA–PKM的物理结合（相互作用）与其对PKM的稳定效应之间是否存在必然关联尚未明确。双分子荧光互补(BIFC, Bimolecular Fluorescence Complementation)可在活细胞环境中检测蛋白–蛋白相互作用，AlphaFold 3可进行蛋白质复合物结构预测。本研究以海兔感觉神经元为模型，结合BIFC、PKM稳定性检测及AlphaFold 3建模，探究KIBRA变异体与PKM Apl I/III的相互作用模式差异及其与稳定化的关系，并发表于《Molecular Brain》。

二、主要关键技术方法

研究人员从加州海兔( Aplysia californica )分离培养感觉神经元，显微注射pNEX3载体表达的mRFP?PKM Apl I/III、eCFP?KIBRA野生型及各变异体（KIBRA_RSR?AAA、KIBRA_splice、KIBRA_R?Q、KIBRA_R?H、KIBRA_stop）质粒。(1) 稳定化实验：共表达mRFP?PKM与eCFP?KIBRA，以共注射eYFP作为注射量内参，在24 h后通过共聚焦显微镜测定神经元突起中mRFP荧光强度/mRFP激发的eYFP强度比值反映PKM稳定水平；(2) BIFC实验：将mVENUS(黄绿色荧光蛋白) N端片段(1?154)与C端片段(155?239)分别融合至KIBRA与PKM Apl III的N端（以GGGGSGGGGS连接肽隔开），共表达后通过宽场荧光显微镜测定突起中重构的eYFP荧光/eCFP注射标记比值反映相互作用强度；(3) 部分实验用抗KIBRA抗体及AlexaFluor?647二抗进行免疫荧光验证KIBRA表达；(4) AlphaFold 3服务器预测KIBRA（含各突变体）与PKM Apl I/III及人Par3底物肽的复合物结构，输入体系中含ATP与2个Mg²⁺，每组合运行5次获得25个模型，用interchain PAE(iPAE)、ipTM、pLDDT及MolProbity clash评估，PyMOL可视化。数据统计采用Kruskal?Wallis检验与Dunn's post?hoc检验。

三、研究结果

KIBRA and PKM Apl III show BIFC, even when they do not show stabilization

研究人员证实KIBRA_WTLong/PKM Apl III Short组合较PKM Apl III Long/PKM Apl III Short及KIBRA Long/KIBRA Short产生显著BIFC信号，证明KIBRA与PKM Apl III在海兔感觉神经元中存在相互作用。进一步检测发现，不能稳定PKM Apl III的KIBRA_RSR?AAA与KIBRA_splice仍与PKM Apl III产生强BIFC信号，且抗KIBRA抗体显示各KIBRA变异体在神经元内表达水平相当。结论：BIFC检测的KIBRA–PKM Apl III相互作用并不等同于KIBRA对该PKM的稳定化作用，二者可解离。

AlphaFold 3 modeling of KIBRA?PKM interactions reveals alternative substrate peptides in KIBRA

AlphaFold 3预测KIBRA与PKM Apl I/III最可靠的相互作用为KIBRA C端一段底物样肽（命名为底物肽SP3，残基1310?1323，含FxR亲和力臂及磷酸化Ser）嵌入PKM催化结构域底物结合口袋，构象类似于人Par3 CR3区底物肽与atypical PKCι的共晶结构。KIBRA上游尚存在另两段保守序列SP1与SP2，亦可被预测以底物样方式进入PKM底物口袋。KIBRA_WT与PKM Apl III主要预测SP3占据底物口袋（低iPAE、高ipTM≈0.88）；PKM Apl I则部分模型显示SP3取替代路径结合PKM Apl I"handle"域（α?螺旋区含Helix 5/G helix，D192等参与），另一部分模型仍为Par3?like路径。KIBRA_RSR?AAA破坏SP3的FxR亲和力臂，使SP3进入底物口袋的预测置信度下降，但SP1或SP2可补偿占据底物口袋并产生较低但可信的相互作用（部分模型仍现低iPAE），解释了为何KIBRA_RSR?AAA仍有BIFC却失去对PKM Apl III的稳定化（SP3特有的抑制臂+后续α?螺旋相互作用缺失）。

A positively charged alpha?helix in KIBRA that interacts with different regions of PKM Apl I and PKM Apl III gains negative changes after splicing

KIBRA SP3下游预测含4个α?螺旋，其中第3个α?螺旋（残基~1419?1440）有一面富集正电荷残基(Arg/Lys/His)，AlphaFold 3预测该正电面可与PKM Apl III αC?螺旋酸性斑(D59/D62/D64)及pT179区域形成盐桥，协同SP3抑制臂稳定KIBRA–PKM Apl III复合物。KIBRA_splice在螺旋2与螺旋3间插入7 aa使原本位于连接肽的负电残基(Glu¹⁴¹²/Glu¹⁴¹⁵，对应splice后为Glu¹⁴¹⁹/Glu¹⁴²²)转入该正电面，改变螺旋表面电荷分布，削弱其与PKM Apl III的相互作用（iPAE升高），但与PKM Apl I handle域酸性斑(E230/D231/E233/E234)的相互作用也减弱，使PKM Apl I中SP3更多采取Par3?like路径进入底物口袋——这与KIBRA_splice能稳定PKM Apl I而不稳定PKM Apl III的实验结果相符。

Effects of KIBRA variants on stabilization and BIFC

研究人员将哺乳动物WWC3疾病相关突变引入对应Aplysia KIBRA位点：R1312Q(KIBRA_R?Q，破坏FxR中R)、R1341H(KIBRA_R?H，影响卷曲螺旋coiled?coil, CC形成)、R1312终止密码子(KIBRA_stop，缺失SP3及下游α?螺旋/CC2)。稳定化检测显示：KIBRA_R?H、KIBRA_R?Q仍可稳定PKM Apl III（与KIBRA_WT比无显著差异），KIBRA_stop（缺失SP3及C端螺旋）意外也能稳定PKM Apl III与PKM Apl I；在KIBRA_splice背景下，KIBRA_spliceR?Q丧失对PKM Apl I的稳定作用，而KIBRA_spliceR?H与KIBRA_stop仍稳定PKM Apl I。BIFC检测显示所有KIBRA变异体（含KIBRA_stop）均与PKM Apl III产生显著高于负对照的BIFC信号。AlphaFold 3分析表明KIBRA_stop因缺失SP3使SP1/SP2更易占据底物口袋且模型clash降低，支持其仍能通过替代底物肽实现稳定；KIBRA_R?Q主要影响PKM Apl I与KIBRA_splice组合中SP3偏好性变化致失稳，对PKM Apl III–KIBRA_WT体系影响较小故仍稳定。

四、讨论与结论总结

研究人员讨论指出，BIFC可捕获瞬时的或中等亲和力的KIBRA–PKM相互作用并使Venus荧光蛋白片段不可逆折叠发出荧光，故BIFC阳性未必代表持续稳定的复合物；而PKM稳定化要求KIBRA持续保护PKM免于降解，需KIBRA底物肽(SP3)以底物样方式占据PKM催化口袋且其C端抑制臂+正电α?螺旋与PKM形成稳定抑制性结合——类似Par3肽对atypical PKC的抑制模式。KIBRA_splice引入负电残基改变正电螺旋面电荷，破坏对PKM Apl III的抑制性互作（失去稳定）但使PKM Apl I中SP3倾向采取Par3?like抑制路径（获得稳定）。KIBRA可通过其底物肽的可磷酸化Ser被PKM自身磷酸化而解离抑制、释放活性PKM执行记忆相关底物磷酸化，属可调控的"抑制–释放"机制。研究局限包括过表达体系可能未包含内源性辅因子（如PICK1、PSD?95等），且仅为预测模型待实验验证。

结论翻译：

本研究结果表明KIBRA与PKM Apl III的双分子荧光互补(BIFC)信号可在无PKM稳定化时发生，揭示KIBRA C端存在多个底物样肽(SP1/SP2/SP3)可与PKM底物结合口袋相互作用，其中SP3与紧随其后的带正电α?螺旋共同介导对PKM的稳定抑制；可变剪接通过改变该α?螺旋表面电荷分布差异化调节KIBRA对不同PKM异构体的稳定能力；KIBRA_RSR?AAA等变异体因SP3亲和力臂破坏使替代底物肽补偿结合产生BIFC却丧失稳定抑制。KIBRA对PKM的稳定化关联于KIBRA将PKM锁定于底物占据的抑制状态，该相互作用经KIBRA底物肽磷酸化可解除以释放活性PKM参与记忆维持，为理解KIBRA–PKM复合物在长时记忆中的双重功能提供了结构–功能框架。