CHD8+/R2219*自闭症小鼠模型中雄性偏倚的社会功能缺损与海马结构异常相关

《Neuroscience Bulletin》：Male-Biased Social Deficits in Chd8+/R2219* Mouse Model of Autism Linked to Hippocampal Abnormalities

　　

自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一种存在4:1男性偏倚的神经发育性疾病，但该性别差异的生物学基础尚不清楚。染色质重塑因子CHD8的杂合突变赋予ASD高风险，其表型受性别和遗传背景影响。研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了携带与人类变异同源突变的Chd8^+/R2219*小鼠。这些小鼠重现了ASD核心特征，包括巨头畸形和类自闭症行为。值得注意的是，社会功能缺损表现出雄性优势，直接反映了人类的性别偏倚。结构磁共振成像（Structural Magnetic Resonance Imaging, sMRI）证实突变鼠存在全脑增大，基于体素的形态学测量（Voxel-Based Morphometry, VBM）识别出双侧海马扩张。关键的是，海马体积与雄性突变鼠的社会功能缺损严重程度相关，而在雌性中不存在这种关联。功能连接分析揭示了海马网络连接紊乱，且与社会相关环路内的连接模式可预测行为结局。综上所述，研究发现该模型表现出显著的性别二态性，并将异常的海马结构和功能连接确定为雄性偏倚社会功能缺损的关键神经相关因素。

该研究发表于《Neuroscience Bulletin》，旨在探究CHD8单倍剂量不足导致自闭症谱系障碍（ASD）雄性偏倚表型的神经生物学机制。ASD是一种高度可遗传的神经发育性疾病，以社会交流与互动障碍、兴趣狭窄及重复刻板行为为核心特征，男性患病率约为女性的4倍。尽管大规模基因组研究已发现多种拷贝数变异和单核苷酸变异，但基因外显率不完全、遗传变异模式多样以及环境与表观遗传机制的复杂交互，给解析ASD病理生理学的遗传贡献带来巨大挑战。临床表型方面，男性ASD患者更多表现出攻击性、多动及刻板/限制性兴趣等外化行为，社交行为减少；女性则更多表现出焦虑和抑郁等内化症状。目前尚不清楚这种性别偏倚是否反映了塑造神经环路发育与功能的突触或神经元机制的根本性性别差异。CHD8（Chromodomain-Helicase-DNA-binding protein 8）是一种染色质重塑因子，作为关键转录调控因子调控众多其他ASD风险相关基因的表达。CHD8单倍剂量不足最一致的临床表型为巨头畸形和高身材，常伴发ASD和/或发育迟缓/智力障碍。研究人员分析SFARI Gene数据库中123例携带CHD8变异的病例，发现明显男性偏倚（87例男性 vs. 36例女性）。既往Chd8单倍剂量不足小鼠模型虽已重现社会障碍、重复行为和认知缺陷等ASD样行为，以及大脑皮层、海马和杏仁核等区域体积增大，但CHD8相关ASD显著男性偏倚的神经机制仍有待探索。为此，研究人员构建并表征了携带人类ASD(ts8相关变异的新Chd8^+/R2219*小鼠模型，采用多模态行为学和神经影像学整合方法，证明该模型重现了雄性偏倚的社会功能缺损，并揭示这一核心表型与海马结构和功能连接改变相关。

研究样本来自经8代回交的C57BL/6N背景Chd8^+/R2219*小鼠及其野生型（Wild-Type, WT）同窝对照。主要关键技术方法包括：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建携带无义突变（c.6655C>T）的转基因小鼠模型；通过Western blot和免疫荧光验证但仍技术验证CHD8蛋白表达及脑区定位；采用Nissl染色进行海马亚区形态计量学分析；应用系列行为学检测（旷场实验、三箱社会交互实验、埋珠实验、转棒实验、明暗箱实验、高架十字迷宫、新异物体识别实验、新异位置识别实验、Y迷宫、Morris水迷宫）评估自闭症相关表型；使用Bruker 9.4T MRI扫描仪配合专用小鼠头部低温线圈进行结构和静息态功能磁共振成像（Resting-State Functional MRI, rsfMRI）；采用SPM12软件进行基于DARTEL算法的图像配准和VBM分析，以高斯随机场（Gaussian Random Field, GRF）校正多重比较；运用AFNI工具进行rsfMRI预处理，FSL的melodic功能进行空间独立成分分析（Independent Component Analysis, ICA）去噪；以海马为种子点进行基于种子点的功能连接分析，选取8个社会相关脑区作为感兴趣区（Region of Interest, ROI）；采用LASSO（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）回归模型结合留一法交叉验证（Leave-One-Out Cross-Validation, LOOCV）构建行为预测模型。

**Chd8⁺/R2219*小鼠的构建与验证**：通过CRISPR-Cas9技术成功构建携带人类致病性变异同源位点（c.6655C>T，使精氨酸2219变为终止密码子）的Chd8^+/R2219*小鼠。Sanger测序和PCR验证基因组编辑成功，Western blot证实突变鼠脑组织中全长CHD8蛋白（~280 kDa）显著减少，呈现单倍剂量不足；纯合突变导致胚胎致死，杂合突变鼠存活且可育，体重正常。与CHD8单倍剂量不足的临床特征一致，突变鼠表现出脑重量增加，皮层长度和总面积增大，且无明显性别差异，Nissl染色未发现明显形态学缺陷。

**Chd8^+/R2219*小鼠表现出类自闭症行为表型**：在三箱社会交互实验中，雄性Chd8^+/R2219*小鼠表现出显著的社会性和社会新颖性偏好缺损，与野生型对照相比具有雄性偏倚的表型特征；而雌性突变鼠与野生型无显著差异。两性突变鼠均表现出重复刻板行为增加，包括自我梳理时间延长、埋珠数量增多以及转棒实验中加速运动学习。焦虑样行为检测显示，雄性突变鼠在明暗箱和高架十字迷宫中焦虑增加，而雌性突变鼠在旷场实验中表现出更广泛的焦虑样表型。新异物体识别实验中，突变鼠对新奇物体缺乏偏好，表明其新奇加工障碍不仅限于社会领域，还扩展到非生命物体。然而，Y迷宫自发交替、新异位置识别和Morris水迷宫测试显示空间和参考记忆保持完整，提示存在特异的新奇识别缺陷，与保留的空间学习和记忆能力相区分。此外，两性突变鼠均表现出全身性低活动表型。

**Chd8^+/R2219*小鼠的性别二态性脑增大及雄性特异性海马-行为相关**：结构MRI显示，两性突变鼠总脑体积均显著增加，符合巨头畸形特征；灰质体积增加驱动该效应，男性更为显著，而白质体积仅在雌性突变鼠中显著增加。全脑VBM的2×2（基因型×性别）方差分析显示，基因型主效应在双侧海马、前额叶皮层和小脑等区域显著；事后分析表明该效应主要由雄性突变鼠的灰质体积显著增加驱动，以海马最为突出。双变量相关分析揭示，双侧海马灰质体积与社会性评分呈显著负相关，即海马体积越大社会性越差，该结构-功能关联具有雄性特异性；此关联具有特异性，与其他脑区体积、焦虑或刻板行为指标无显著相关，且在野生型同窝鼠中不存在。海马体积与社会新颖性偏好无显著相关。

**Chd8^+/R2219*小鼠海马亚结构改变及功能网络异常**：鉴于雄性突变鼠显著的双侧海马增大及其与社会性的关联，研究人员进一步聚焦该脑区。基于AMBMC（Australian Mouse Brain Mapping Consortium）图谱的ROI分析确认，雄性突变鼠多个海马亚区（CA1、CA2、CA3和DG）灰质体积显著增加。Nissl染色形态计量学显示CA1和CA3锥体细胞层显著增厚，DG、CA1和CA3亚区均表现出体积扩张，验证了MRI发现并表明雄性突变鼠海马形成存在全面的结构重组。功能连接分析以海马为种子点，定量分析其与8个先验社会相关脑区（前扣带皮层ACC、伏隔核NAc、杏仁核、边缘下皮层IL、眶额皮层OFC、前边缘皮层PrL、初级躯体感觉皮层SSC、腹侧被盖区VTA）的连接。单变量线性回归显示，任何单一海马-社会ROI连接与行为均无显著双变量相关。因此采用多变量模式分析（Multivariate Pattern Analysis, MVPA）框架，检验整个网络协调的连接特征是否能预测社会功能。机器学习方法整合所有8个社会ROI的连接模式，在突变鼠中稳健预测社会性结局；该预测关系对突变雄性表型具有特异性，在雄性野生型同窝鼠和雌性突变鼠中均不成立。亚区特异性分析进一步扩展MVPA框架至CA1、CA3和DG等单个海马亚区种子点，限制预测变量不超过4个以减轻过拟合；在所有检测的种子点中，左侧海马整体对社交性和社会新颖性均具有最强的预测能力。

**讨论**：Chd8^+/R2219*小鼠重现了人类CHD8单倍剂量不足综合征的关键特征，包括巨头畸形、社会功能缺损、重复刻板行为和焦虑样表型。研究识别出Chd8功能缺失的性别特异效应：雄性突变鼠表现出特异性社会障碍，与海马增大及功能连接改变相关，突出了该模型的显著性别二态性，并提示海马环路可能是雄性特异性易感性的基础。SFARI Gene数据库分析证实CHD8变异存在显著男性偏倚（87:36），多数为新生变异，表型异质性高。该模型与其他Chd8下调模型相比，其雄性特异性社会障碍的行为表型和性别二态性具有独特性，为研究ASD性别差异提供了有价值的临床有不少前景的平台。神经影像学发现，基因型驱动的灰质体积增加主要由雄性小鼠驱动；雄性突变鼠中，海马体积与社会性呈负相关，且海马为中心的连接网络协调性可预测社会行为结局，而与野生型无关，提示该预测能力可能源于病理性海马结构重组。然而，研究存在局始终：海马连接预测模型样本量相对较小（n=11只雄性突变鼠），尽管采用LOOCV和约束模型复杂度减轻过拟合，统计效力和结果外推性仍可能受限；且观察到的相关性仍需确定因果关系。未来研究需针对雄性突变鼠的发育、 nutshell、环路、突触或分子发现进行定向操控，并阐明该模型中雄性优势异常的性别二态机制，包括性染色体效应、性器官激素的组织化和激活化影响，以及催产素系统等关键候选通路的作用。这种整合性方法将有助于解析雄性ASD易感性的机制，并识别关键发育窗口和治疗干预靶点。研究结论认为，Chd8^+/R2219*小鼠模型表现出显著的性别二态性，异常海马结构和连接是雄性偏倚社会功能缺损的关键神经相关因素。