用于模拟脑实质病变诱导屏障功能障碍的人血脑屏障-脑类器官毫微流控板（Human BBB-Brain Organoid on a Millifluidic Plate for Modeling Brain Parenchymal Pathology-Induced Barrier Dysfunction）

《Journal of Advanced Research》：Human BBB-brain organoid on a millifluidic plate for modeling brain parenchymal pathology-induced barrier dysfunction

　　

摘要：血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）维持脑内稳态，其功能障碍是多种神经系统疾病的核心病理机制。然而，现有BBB模型缺乏功能性脑实质（brain parenchyma），阻碍了对BBB-脑实质相互作用的机制研究，也限制了针对屏障穿透及神经靶向的药物评价。本研究旨在开发一种集成化的人血脑屏障-脑类器官-on-a-chip（BBOC）模型，以重现BBB与脑实质间的生理互作及病理性破坏。研究人员在毫微流控板（millifluidic plate）上利用人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells, hBMECs）和周细胞（pericytes）在动态流条件下构建生物工程BBB模型，共培养人多能干细胞来源的脑类器官（human pluripotent stem cell-derived brain organoids, hBOs）形成BBOC体系。采用Aβ42寡聚物（Aβ42oligomers, Aβ42O）诱导脑实质病变，考察其对BBB功能与完整性的影响。结果表明，条件培养基（conditioned medium, CM）与动态流提高了内皮细胞活力；与hBOs共培养显著增强工程BBB功能，提高跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance, TEER）值并降低分子通透性。经Aβ42O处理的hBOs表现出脑实质病理表型，包括明显神经突（neurite）丢失、干细胞增殖受损、细胞凋亡增加及细胞因子基因转录上调。病理性hBOs可破坏BBB，表现为紧密连接蛋白表达下降、屏障通透性增加及屏障完整性受损。结论：BBOC模型再现了脑实质与BBB间的生理及病理互作，证实脑实质活性直接调控BBB完整性。功能上，hBOs通过旁分泌信号促进内皮屏障成熟与稳定；反之，病理性hBOs诱导周细胞退变及BBB紧密连接破坏，证明病理性脑微环境可直接损害BBB功能。该BBOC模型通过桥接神经生物学与生物工程学，将促进神经系统疾病机制研究及针对屏障穿透与神经靶向的药物研发。

论文解读：用于模拟脑实质病变诱导屏障功能障碍的人血脑屏障-脑类器官毫微流控板模型研究

研究背景与意义

血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB）是由脑微血管内皮细胞经紧密连接（tight junctions）、周细胞（pericytes）及星形胶质细胞末梢共同构成的神经血管单元（neurovascular unit, NVU），负责维持脑内稳态并调控血液与脑实质间的物质交换。大量证据表明，神经退行性疾病（如阿尔茨海默病 Alzheimer's disease, AD）早期即出现BBB渗漏，且脑实质本身的病理改变——包括神经元损伤、胶质细胞表型异常及炎性因子释放——被认为是驱动BBB功能障碍的重要因素。然而，传统体外BBB模型（如Transwell、静态器官芯片）普遍缺失功能性脑实质组分及其代谢微环境，无法重现脑实质与BBB之间的双向调节机制，也难以用于评价药物穿越BBB后对脑实质的作用。为此，Zhu Lili、Zhao Wen、Shen Min等研究人员在《Journal of Advanced Research》上发表了此项工作，构建了一种整合人源脑类器官（human brain organoids, hBOs）与生物工程BBB的毫微流控芯片模型（BBOC模型），以模拟生理及AD相关病理状态下脑实质与BBB的互作关系，验证"脑实质健康状态主动调控BBB完整性"这一假说，并为神经药物筛选提供更具生理相关性的平台。

主要关键技术方法

研究人员采用激光雕刻PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）制备含PETE（聚酯）多孔膜插件的12孔毫微流控板，通过倾斜摇床产生重力驱动双向层流以模拟脑微血管剪切应力，并利用COMSOL进行流场与营养物质扩散数值模拟。原代人脑微血管内皮细胞（hBMECs）与原代脑血管周细胞（hBVPs）分别接种于膜下室与上室共培养建立BBB模型，使用内皮细胞培养基与周细胞培养基按1:4混合的条件培养基（conditioned medium, CM）维持细胞。人胚胎干细胞（H9 hESCs）经改良Lancaster方案诱导分化为第23天（D23）脑类器官（hBOs），加载至BBB模型上室共培养构建BBOC模型。以5 μM Aβ₄₂寡聚物（Aβ₄₂O）处理hBOs 72 h诱导脑实质病理表型，洗涤后接入成熟BBB构建病理BBOC模型。功能表征手段包括：逐日监测跨内皮电阻（TEER）；10 kDa与70 kDa FITC-葡聚糖（FITC-dextran）表观渗透系数（apparent permeability coefficient, P_app）测定；RT-qPCR检测内皮紧密连接（tight junction, TJ）基因（CLDN5、OCLN、ZO-1）、外排转运体（P-gp）、周细胞标志物（PDGFR-β、NG2）及炎性细胞因子（IL-1β、TNF-α、HLA-DR、CX3CR1）mRNA水平；Western blot及免疫荧光染色分析内皮、周细胞及hBOs中神经标记物（SOX2、Nestin、PAX6、TUJ1、MAP2、Ki67）与功能蛋白（CD31、VE-cadherin、ZO-1、PDGFR-β、Claudin-5）；TUNEL法检测hBOs细胞凋亡。

研究结果

Design and fabrication of a millifluidic plate（毫微流控板的设计与制备）

研究人员设计并在12孔板中嵌入带0.4 μm PETE多孔膜的上下腔室插件，由倾斜摇床产生周期性双向重力流。数值模拟显示上下腔流体速度3–5×10^-2cm/s，膜底部内皮侧受约0.022 dyn/cm²剪切应力，染料灌注实验证实上下腔营养物可在1 h内充分扩散。结论：该毫微流控板可提供稳定的低剪切动态流环境与高效的营养交换。

Conditioned medium enhances endothelial barrier properties（条件培养基增强内皮屏障特性）

将内皮细胞培养基（ECM）与周细胞培养基（PM）按1:4混合作为条件培养基（CM）。CCK-8实验显示CM较单一培养基显著提高hBMECs与hBVPs存活率；RT-qPCR显示CM不影响hBMECs中ZO-1、P-gp及hBVPs中PDGFR-β、NG2的基础表达，但单层hBMECs在CM中培养TEER显著升高，10 kDa FITC-dextran通透性降低，CLDN5 mRNA上调。结论：优化的CM在维持细胞表型的同时提升原代内皮屏障功能与共培养稳定性。

Establishment of monolayer endothelial cells under dynamic conditions（动态条件下单层内皮细胞的建立）

比较静态与重力驱动双向动态流下hBMECs单层培养，两者TEER值、FITC-dextran通透性及紧密连接基因（CLDN5、OCLN、ZO-1、P-gp）mRNA表达无显著差异；动态组CD31荧光强度略增，VE-cadherin与ZO-1沿单层连续分布。结论：本研究中采用的温和剪切动态流未显著改变屏障电阻值，但轻微促进内皮形态重塑，细胞活性良好。

Establishment of BBB model（BBB模型的建立）

hBMECs接种于膜下腔、hBVPs接种于上腔共培养，第5天BBB模型TEER（74.50±22.80 Ω·cm²）较单层内皮（50.73±9.13 Ω·cm²）提高46.86%，并维持8天；10 kDa FITC-dextran P_app（1.64±0.47×10^-7cm/s）较单层降低约33.6%；紧密连接与P-gp基因mRNA上调1.55–2.01倍；CD31、VE-cadherin、ZO-1特异性分布于内皮侧，PDGFR-β分布于周细胞侧。结论：原代hBMECs与hBVPs共培养结合动态流可建立具生理相关性的人源BBB模型。

The hBOs promote BBB function（hBOs促进BBB功能）

D23 hBOs接入BBB上室共培养7天后，hBOs保持神经祖细胞（SOX2、Nestin）与神经元（TUJ1、MAP2）标记物表达及前脑/后脑区域特征（PAX6、ISL1），未受芯片共培养影响。BBOC模型第5天TEER达86.31±18.37 Ω·cm²，较单纯BBB模型提高20.53%；10 kDa FITC-dextran P_app降至9.50±4.32×10^-8cm/s（降幅约42.78%）；Claudin-5蛋白表达上调1.22倍，ZO-1分布连续；周细胞功能基因PDGFR-β与NG2 mRNA分别上调9.40与15.14倍，硅胶球对照组无此效应。结论：功能性hBOs通过旁分泌通讯上调周细胞功能基因并促进紧密连接蛋白表达，显著增强工程BBB屏障功能，证实正常脑实质信号主动维持BBB成熟与稳定。

The hBOs exhibit pathological phenotypes of brain parenchyma（hBOs表现出脑实质病理表型）

5 μM Aβ₄₂O处理hBOs 72 h后，TUJ1阳性面积与蛋白量分别降低1.46与1.35倍，SOX2/Ki67双阳性细胞比例降低1.47倍，TUNEL阳性细胞比例升高2.50倍；炎性因子IL-1β、TNF-α、HLA-DR、CX3CR1 mRNA上调1.21–1.68倍。结论：Aβ₄₂O成功诱导hBOs出现神经突丢失、干细胞增殖抑制、凋亡增加及炎症因子上调的综合脑实质病理表型。

The hBOs with pathological phenotypes impair BBB function（具病理表型的hBOs损害BBB功能）

将Aβ₄₂O处理后的病理性hBOs与成熟BBB共培养3天，70 kDa与10 kDa FITC-dextran P_app分别增至2.29±0.82×10^-7cm/s（增幅600.30%）与8.06±1.44×10^-7cm/s（增幅186.83%）；内皮CD31、CLDN5、OCLN mRNA下调1.23–1.76倍；周细胞PDGFR-β平均荧光强度降1.10倍、覆盖面积降14.77倍（提示周细胞脱离）；内皮CD31强度与覆盖度降低；ZO-1表达不连续、阳性面积与长度分别降1.27与3.37倍。结论：病理性脑实质微环境引起BBB紧密连接破坏、周细胞退变及内皮功能障碍，导致屏障通透性显著增加，证明脑实质病变本身足以驱动BBB损伤。

讨论与结论总结

讨论部分指出，该BBOC模型通过引入hBOs填补了传统BBB-on-a-chip缺失脑实质组分的空白，在生理状态下hBOs分泌信号上调周细胞标志基因并增强紧密连接，证实脑实质对BBB的正向调控；在Aβ₄₂O诱导病理状态下，hBOs源性炎性因子上调和/或病理性细胞外囊泡可能介导BBB紧密连接下调与周细胞脱离，重现了AD相关"脑实质病变→BBB破坏"级联反应。作者亦说明本模型使用D20–30早期hBOs（以神经祖细胞与神经元为主，星形胶质细胞未完全成熟，无原位小胶质细胞），未来可通过引入更成熟hBOs或血管类器官组装体进一步完善NVU重构，并计划用于神经药物屏障穿透与神经靶向性评价。

结论部分翻译如下：

现有BBB模型缺乏功能性脑实质及其复杂代谢微环境，无法重现BBB与脑实质间复杂互作。本研究通过整合脑类器官与BBB结构开发了新型BBOC模型以模拟脑实质病变诱导的屏障功能障碍。研究人员发现hBOs显著增强由人脑微血管内皮细胞与周细胞重建的生物工程BBB屏障功能；经Aβ₄₂O处理的hBOs在体外表现出脑实质病理表型，并诱导明显的BBB破坏，包括紧密连接蛋白表达降低、屏障通透性增加及屏障完整性受损。未来研究人员将通过测试已知影响BBB完整性的化合物验证该模型在药物筛选中的可靠性。作为研究BBB与脑实质间生化互作的新型工具，该模型有望应用于神经系统机制研究及药物发现——特别是新一代麻醉药物、神经肽及脂质纳米颗粒的BBB透过性、脑实质毒性和疗效评估。