通过电脉冲刺激( Electrical Pulse Stimulation, EPS)增强人神经-肌肉类器官(Neuromuscular Organoids, NMOs)的成熟化

《Advanced Science》：Enhancing Maturation of Human Neuromuscular Organoids via Electrical Stimulation

　　

摘要：源自人多能干细胞(human Pluripotent Stem Cells, hPSCs)的类器官已成为研究发育与疾病的重要模型。尽管类器官具有生理相关性，但其预测价值受限于组成细胞的未成熟状态，这对成人生理及晚发性疾病的机制研究构成重大挑战。本研究建立一种通过慢性电脉冲刺激(Electrical Pulse Stimulation, EPS)促进人神经-肌肉类器官(Neuromuscular Organoids, NMOs)成熟化的策略。研究人员证明，在NMO发育早期施加并维持数周的低频EPS可增强神经-肌肉成熟及功能输出。无论刺激波形参数如何，经EPS训练的NMOs(EPS-NMOs)表现出更强且更频繁的自发收缩，且该现象在停止刺激后持续存在。定量成像与转录组分析显示EPS-NMOs在骨骼肌肉与神经组织形态上有显著改善，谱系特异性生物标志物的协调调控，以及神经-肌肉成熟相关基因程序的上调。力学生物学测量进一步表明EPS-NMOs组织刚度增加、舒张动力学加快，符合增强的兴奋-收缩偶联(Excitation-Contraction Coupling, ECC)与肌力生成。综上，这些发现确立EPS作为一种强效、非侵入且可按需调控的方式，用于促进复杂类器官系统的形态与功能成熟化。

论文解读：《通过电脉冲刺激(EPS)增强人神经-肌肉类器官(NMO)的成熟化》

研究背景与立项依据

三维(3D)人源类器官(Organoids)能模拟体内组织的三维(3D)细胞结构、多样性及细胞间互作，是研究人体发育与疾病的有力体外模型。然而，类器官细胞通常停滞于胎儿或新生儿早期阶段，难以达到成体组织成熟状态，这限制其用于成人发病疾病（如肌萎缩侧索硬化症 ALS、阿尔茨海默病 AD）建模及药物筛选。现有促进成熟策略（长期培养、共培养、移植）效果有限。生物物理信号如电脉冲刺激(Electrical Pulse Stimulation, EPS)已知可驱动骨骼肌与心肌功能成熟，但在早期发育阶段对整合了神经元与肌肉的神经-肌肉类器官(Neuromuscular Organoids, NMOs)中神经-肌肉接头(Neuromuscular Junction, NMJ)形成及双向信号传导的影响尚不明晰。本研究假设在NMO发育早期引入EPS可模拟生理性生物电信号，从而促进其形态与功能成熟。

主要关键技术方法

研究人员采用两种人诱导多能干细胞(hiPSCs)系——WTC-11（带Titin-mEGFP荧光标记，WTC^mTTNGFP）与KOLF2.1J，定向分化为神经中胚层祖细胞(Neuromesodermal Progenitors, NMPs)后诱导生成3D NMOs。设置早期（第30天，NMJ形成起始）与晚期（第50天，功能性NMJ已建立）两个时间窗口进行EPS训练，筛选优化参数为双相矩形交流脉冲0.5 Hz、10 V、10 ms，隔日刺激30分钟。开展急性（10天）与慢性（约1个月，含恒压稳定参数与渐进递增参数两组）EPS训练。通过免疫荧光(Immunofluorescence, IF)标记（α-Bungarotoxin/α-BTX标记AChR簇、TUBB3神经元、Fast MyHC肌纤维、GFAP星形胶质细胞、ChAT胆碱乙酰转移酶、PAX7卫星细胞等）及共聚焦/高内涵成像定量NMJ数量、大小、支配情况及肌管特征。进行透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察突触超微结构。利用微电极阵列(Multi-Electrode Array, MEA)与谷氨酸诱导钙成像检测神经元电活动与网络同步性。采用块转录组测序(Bulk RNA-seq)分析差异基因与富集通路。通过定制显微拍摄与图像处理管线提取NMO自发收缩位移(Mean Displacement)、收缩功率(Contraction Power)、高于阈值收缩占比及谷氨酸/电诱发收缩反应。借助应变分析与弛豫时间常数(tau)评估类器官组织刚度与力学松弛特性。统计学采用Welch校正非配t检验。

研究结果

2.1 建立NMO的EPS训练范式(Establishing an EPS Training Paradigm in NMOs)

通过参数筛选确定0.5 Hz、10 V、10 ms双相脉冲可诱导体外同步生理收缩。比较早期(d30起始)与晚期(d50起始)10天短期EPS发现：早期EPS组NMJ绝对数量、支配率及>5 μm大型NMJ尺寸在d40显著增加并部分延续至d60，且d60自发收缩增强；晚期EPS组仅d60自发收缩略增，NMJ形态无显著变化。两组EPS均未影响NMO生长或引起凋亡(cCas-3/TUNEL)。表明发育早期是EPS促进NMJ形成与成熟的最佳时间窗。

2.2 电脉冲刺激以时间依赖性方式调节NMJ形态与功能(Electrical Pulse Stimulation Modulates NMJ Morphology and Function in a Time-Dependent Manner)

确认早期窗口优越性后，10天短期EPS即改善NMJ形态与功能，但效应具瞬时性，提示需延长刺激以获得稳定成熟表型。

2.3 慢性电脉冲刺激增强NMJ成熟状态且与脉冲参数无关(Chronic Electrical Pulse Stimulation Enhances NMJ Maturation Status, Independent of Pulse Parameters)

自d30起进行约1个月慢性EPS（稳定组：0.5 Hz/10 V/10 ms；递增组：0.5–1 Hz/5–10 V/2–10 ms，隔日30 min）。结果显示：两组均显著提升d60时>5 μm成熟NMJ的数量、尺寸及支配水平，自发收缩位移、功率及频率显著升高且停药两周后仍维持。递增参数组NMO体积略减小但无凋亡，提示向加速分化/成熟偏移。在KOLF背景NMOs中复现上述NMJ与收缩功能增强。表明慢性EPS无论恒频或渐增参数均可驱动NMO成熟。

2.4 转录组分析揭示慢性EPS诱导NMO成熟(Transcriptional Analysis Reveals Chronic Electrical Pulse Stimulation-Induced Maturation of NMOs)

d40（急性EPS）仅少数基因差异表达；d60（慢性EPS）稳定与递增组分别上调46与52个基因（29个共有），富集于神经元树突/轴突导向、髓鞘化、肌肉收缩、肌发生通路，包括ARHGEF15（突触成熟）、COL4A1/COL5A3/ITGA1（细胞外基质Extracellular Matrix, ECM支撑与NMJ维持）及ANXA1/MYH9等。证实EPS通过富集神经-肌肉成熟功能通路驱动成熟而不改变NMO身份。

2.5 慢性EPS训练期间NMO神经组织的动态成熟化(Dynamic Maturation of NMO Neural Tissue During Chronic Electrical Pulse Stimulation Training)

慢性EPS增加神经区GFAP⁺星形胶质细胞面积及ChAT⁺运动神经元表达与轴突投射至肌区界面，S100β⁺与SOX10⁺终末施万细胞(Schwann cells)与NMJ样结构关联增强。MEA显示EPS-NMOs平均放电率约2倍增加、爆发间期(Interspike Interval, ISI)缩短、跨电极归一化互相关面积增大，表明神经元兴奋性、网络同步性及连接性提高。钙成像示稳定参数组钙瞬变幅度降低（提示成熟回路精细调控），递增参数组衰减时间延长。综上EPS促进NMO神经网络功能成熟。

2.6 慢性EPS对骨骼肌成熟的双重作用(Dual Role of Chronic Electrical Pulse Stimulation in Skeletal Muscle Maturation)

慢性EPS使肌区PAX7⁺/Ki67⁺卫星细胞群维持或扩增，MYOD1(Myoblast Determination protein 1)表达提前降低（趋向成熟肌纤维）。肌管/肌纤维数目与直径增加，NMJ/肌纤维比值升高。基因显示AChR γ-to-ε亚基转换(CHRNE/CHRNG)及成熟/胎儿肌球蛋白重链(Myosin Heavy Chain, MyHC)比值(MYH2/MYH3、MYH4/MYH3)上升。TTNGFP荧光显示肌纤维更长更整齐。谷氨酸诱发收缩更强。COL4A1(IV型胶原)蛋白在肌区间隙显著上调。力学测试示EPS-NMOs峰值应变(Strain)更大、弛豫时间常数(tau)更小（更快松弛、更高刚度），符合增强的兴奋-收缩偶联(ECC)与力传递。表明EPS促骨骼肌形态、分子标记及力学生物学成熟。

讨论与结论总结

研究人员发现，将低频慢性EPS与NMO发育时间窗（NMJ形成起始d30）匹配是促成熟关键；早期EPS可能通过增强AChR聚集促进突触发生，晚期EPS则主要强化骨骼肌ECC。慢性（~1月）EPS上调神经-肌肉成熟相关转录程序但不改变类器官属性，且稳定与递增参数均可生效但通过不同通路。神经侧表现为星形胶质细胞增多、运动神经元成熟投射、终末施万细胞关联NMJ及MEA网络同步性增强。肌肉侧表现为MYOD1下调、PAX7⁺池维持、肌纤维肥大/排列改善、AChR ε亚基表达升高、ECM(COL4A1)沉积增加及力学刚度/收缩-松弛性能提升。局限性含hiPSC遗传背景需拓展、EPS通量低、使用Bulk RNA-seq及未行单细胞解析。结论：低频慢性电脉冲刺激(EPS)是一种非侵入、可按需调控的生物物理手段，能显著促进复杂人神经-肌肉类器官(NMOs)的形态与功能成熟化，为构建更接近成体的人源体外生理与疾病模型提供了新范式。该研究发表于《Advanced Science》(Advanced Science)。