突变率估算的精确性如何？不同从头突变率估算方法的比较

《Heredity》：How precise are mutation rate estimates? Comparison of different approaches to estimate de novo mutation rates

　　

近年来，基于生物信息学验证方法的从头突变率（μ）估算数据急剧增加，但这些估算的准确性和精确性往往仍不清楚，因为这些突变常常缺乏Sanger测序验证。研究人员利用长读长和短读长测序数据以及不同的生物信息学流程，对扁头鳅（Oreonectes platycephalus）亲子三代家系进行了μ以及假阳性率（FPR）和假阴性率（FNR）的估算。通过与PCR验证的突变进行比较，研究人员观察到表现最佳的方法（在相同测序深度下七种方法中按F1评分排名）仍存在4%的假阳性率（FPR）和12%的假阴性率（FNR）。在其余方法中，FPR值范围为4-12%，FNR值范围为8-19%。无论使用何种生物信息学方法，长读长数据产生的μ估算值始终低于短读长数据，这是由于可调用基因组（callable genome）更大所致。此外，更高的比对深度导致更低的FNR。这些结果提醒研究人员，对于非模式生物中未经Sanger测序验证的从头突变需谨慎对待，并提示许多已发表的μ估算值（尤其是基于低比对深度的研究）可能存在偏倚。

## 研究背景与问题

从头突变（de novo mutations, DNMs）是自发产生的遗传改变，在遗传学和进化生物学中具有深远意义。生殖系DNMs一旦发生便可遗传给下一代，增加遗传多样性，可能促进新的适应性进化和遗传分化；但若具有有害性，则可能对适合度产生负面影响。无论适应性或有害性，准确的DNM率估算对于理解突变率的进化至关重要，同时在种群遗传学中也发挥着关键作用，如推断分化时间、有效种群大小和迁移率等。

近年来，亲子三代（parent-offspring, PO）家系的直接测序并计数一代内发生的突变，已成为DNM率估算的主流方法，因为除致死突变外，选择无法在单代内消除突变。然而，由于每代预期的DNM数量较少，且测序和比对错误使鉴定变得复杂，真正DNM的稳健鉴定仍具挑战性。特别是对于短寿命物种，由于其每代DNM数量远少于长寿命物种，即使单个假阳性（false positive, FP）也可能显著扭曲结果，因此最小化假阳性对于通过PO家系方法准确检测DNM至关重要。

许多近期研究依赖生物信息学策略而非Sanger测序验证来最小化假阳性。一项对已发表研究的汇总分析显示，在38项使用PO家系方法估算动物界DNM率的研究中，仅39%通过实验方法（如Sanger测序）验证了DNM，其余仅依赖生物信息学验证。然而，基于软件验证的准确性尚未得到评估，这引出了一个关键问题：缺乏Sanger测序进一步验证时，该方法是否可靠？

大多数基于PO家系的DNM研究采用短读长测序（short-read sequencing, SRS；如Illumina HiSeq、DNBseq、BGISEQ500），因其成本效益高且单碱基错误率低。但SRS在准确捕获高度复杂的基因组区域（如重复序列、存在插入缺失或结构变异的区域）方面面临挑战。相比之下，长读长测序（long-read sequencing, LRS）可生成大于10 kb的读长，已被证明能改善插入缺失和其他结构变异的检测。方法学差异可能直接导致DNM检测和可调用基因组计算方面的不同表现，从而影响DNM率估算。此外，测序深度对于以最小假阳性和假阴性稳健鉴定DNM同样关键，但确定测序深度需要在成本和效益之间权衡。

## 研究目的

本研究的主要目的有两个方面：第一，比较有无Sanger测序验证的DNM验证方法在控制假阳性方面的表现；第二，比较不同测序策略和测序深度对DNM检测的影响，并估算这些方法的假阳性率和假阴性率。

## 关键技术方法

研究人员以二倍体淡水鱼类扁头鳅（Oreonectes platycephalus）为研究对象，该物种具有高质量、明确定义、染色体锚定、单倍型解析的参考基因组。研究团队从香港龙虎山采集了一对亲本个体，在实验室条件下自然繁殖获得6个子代，构建了8个样本的亲子三代家系。DNA从胸鳍提取后，分别进行长读长和短读长测序：长读长测序采用PacBio Revio^TM HiFi技术在Annoroad Gene Technology Co.完成，目标深度为30×；短读长测序采用DNBSEQ^TM T7平台在Berry Genomics完成，原始深度约45×，后下采样至30×以进行公平比较。变异检测采用三种生物信息学流程：GATK v4.5.0.0、DeepVariant v1.6.1和DeepTrio v1.6.1，同时构建了混合（hybrid）数据集（LRS+SRS）并使用DeepVariant进行分析。为测试深度的影响，混合数据被下采样至15×、30×、45×、60×和75×。所有候选DNM经过一系列过滤（包括孟德尔遗传违规筛选、基因型质量过滤、读深过滤、等位基因深度过滤、等位基因平衡过滤、聚类突变位点检查，以及IGV可视化验证）后，通过Sanger测序进行实验验证。

## 研究结果

**变异概述与DNM鉴定**：在约30×平均比对深度下，研究人员从扁头鳅家系中检测到32个候选DNM，经Sanger测序验证后确认26个为真正的DNM（每个子代2-6个，平均4.3个），其中1个位于外显子、11个位于内含子、14个位于基因间区，3个位于重复区域内，包含3个在兄弟姐妹间共享的DNM。在21个独特的验证DNM中，转换（transition, Ts）占47.61%，颠换（transversion, Tv）占52.38%，Ts:Tv比值为0.91。最常见的突变类型为C:G到T:A转换，其中三分之一位于CpG位点。此外，Sanger测序鉴定出4个假阳性，全部位于内含子，其中1个位于重复区域；2个候选位点因PCR扩增失败未能验证。

**不同方法的表现比较**：在七种不同方法中，基于DeepVariant的方法表现最优，具有最低的假阳性率和假阴性率。SRS_DeEPTRIO也展示了均衡的性能，但LRS_DeEPTRIO的假阴性率高于基于DeepVariant的方法。相比之下，无论使用LRS还是SRS，基于GATK的方法都面临显著的敏感性挑战（FNR>15%）和特异性问题（FPR~10%）。假阴性位点主要源于等位基因平衡比值超出0.3-0.7阈值。基于SRS的方法的可调用基因组（callable genome, CG）大小显著小于基于LRS的方法。当计算不同方法间DNM候选的交集时，16个DNM被所有方法共同鉴定，其FPR为0%；反之，若某个DNM候选仅被七种方法中的一种或两种鉴定，则为假阳性，这表明综合多种方法可实现更准确的DNM检测。

**比对深度对DNM检测的影响**：研究人员将混合测序数据下采样至15×、30×、45×、60×和75×，使用DeepVariant进行变异检测。结果显示，比对深度与FNR之间存在明显的负相关关系（r²=0.51，F₂₅=6.578，p<0.05）。在低深度时，FNR高度可变，甚至一度达到100%；但随着深度增加至约45×以上，FNR降低并稳定至接近0%。对于FPR，15×和30×数据集比较高深度多检测了一个位点。

**方法的定量比较**：当比对深度达到45×或以上时，混合方法实现了最高的F1评分（0.98）；降至约30×时，混合方法的F1评分仍超过0.9；而降至约15×时，F1评分降至0.76。对于SRS数据，DeepTrio和DeepVariant方法达到相同性能（F1评分=0.92），而GATK方法的F1评分低于0.9。对于LRS数据，DeepVariant方法的F1评分（0.91）高于其他两种方法（0.86）。无论测序方法如何，使用DeepVariant进行变异检测似乎优于其他方法。

**突变率估算**：当深度增加至约45×或以上时，平均μ超过5.20×10^-9 /bp/代，而其余平均估算值均低于5.00×10^-9，无论使用何种变异检测软件。通过Hybrid_15×方法估算的μ显著低于Hybrid_45×（配对t检验，t₅=2.20，umo p=0.04）、Hybrid_60×（t₅=2.33，p=0.03）和Hybrid_75×（t₅=2.17，p=0.04）方法，反映了其高FNR的影响。基于LRS数据的生殖系从头突变率估算值始终低于基于SRS的数据，但差异不显著（Welch t检验，t₂=3.93，p=0.09）；然而，CG存在显著差异（ANOVA，F₄=7.41，p=0.001）。采用Hybrid 45×、60×和75×的平均μ估算值（F1评分相同），扁头鳅的最终最佳从头突变率估算值为5.23×10^-9 /bp/代。

## 讨论与结论

研究人员比较了有无Sanger测序验证的方法效果，发现仅使用生物信息学方法不足以过滤假阳性，导致突变率的大幅高估。鉴于超过半数早期研究仅依赖生物信息学验证，这些研究的突变率很可能被高估了。由于生物信息学可视化工具似乎缺乏精确性，通过Sanger测序估算FPR变得至关重要。然而，在非模式物种中设计Sanger测序实验可能具有挑战性，尤其是在重复区域。尽管如此，即使难以在多代家系研究中检验每个候选DNM，也可检验一部分候选DNM来估算FPR。

长读长测序被广泛认为是改善跨重复区域、增强变异检测（尤其是结构变异检测）的改进策略。然而，基于LRS数据的SNV位点从头突变率研究很少。本研究中，三种变异检测软件从LRS数据中平均鉴定出22.33个真正的点突变DNM，与经Sanger测序验证的SRS数据鉴定数量相等，表明使用LRS数据检测从头点突变未必优于使用SRS数据。这与早期研究估算LRS数据高于SRS数据的结论形成对比，但早期研究均基于人类数据，具有先进的参考基因组、特征明确的变异数据库和利用多代家系数据的先进测序技术。相比之下，非模式生物往往缺乏无间隙的端粒到端粒（T2T）参考基因组和基准数据，使得有效调整过滤参数变得更加困难。因此，在非模式物种的DNM率估算中，FNR和FPR问题可能更为突出，需要定制化的分析方法。

研究人员注意到，GATK最初为SRS数据设计，可能影响了其在LRS数据上的表现，但本研究中GATK数据集在LRS和SRS数据间显示了相等的F1评分。深度学习基础的变异检测工具（如DeepVariant和DeepTrio）已知比传统算法工具产生更高的F1评分。在本研究中，GATK始终产生最低的F1评分，与文献综述观点一致。虽然DeepTrio专为亲子变异检测设计，但在LRS数据集中其F1评分低于DeepVariant，可能是由于模型主要基于人类数据训练，限制了其在非模式物种中的有效性。研究结果表明，在相同比对深度（30×）下，DeepVariant可能是DNM检测的最佳选择。

除测序策略和变异检测方法外，比对深度也是影响DNM检测的重要因素。虽然15×深度历史上被推荐用于可靠的SNV检测，但本研究表明该深度不足以进行稳健的DNM检测，表现为高FNR（0.35）和所有测试深度中最低的F1评分（0.76）。这种差异源于区分稀有真实DNM与背景测序噪声需要比检测常见SNV更严格的统计阈值。大多数基于PO家系的DNM研究采用30×至50×测序深度，而本研究发现45×（F1评分=0.98）的性能远优于30×（F1评分=0.86）。值得注意的是，进一步将深度增加至60×或75×未能带来额外的准确性增益，性能指标与45×保持相同。这种平台效应表明，45×代表了混合测序流程中高置信度DNM检测的成本效益基准，提供了敏感性、特异性和资源支出之间的最优平衡，显著高于Bergeron等人（2022）先前为SRS方法推荐的35×深度。

突变率估算（μ）不仅取决于DNM数量，还取决于可调用基因组大小（CG）和过滤假阴性率（fFNR）。值得注意的是，基于SRS的方法产生的μ始终高于基于LRS的方法。LRS方法始终实现最大的可调用基因组大小，而SRS方法的可调用基因组显著较小，这与LRS在跨越重复基因组区域和解析复杂结构变异方面的已知优势一致。尽管本研究中SRS和LRS方法检测到的DNM数量几乎相等，且fFNR值相似（SRS_DeEPTRIO除外），但其μ估算值的差异可能源于CG大小的变化。然而，μ的决定因素在深度间表现出不同模式：CG大小对测序深度不敏感，而fFNR与深度强相关。30×混合数据集实现了最大的可调用基因组大小，显著优于其他深度产生的混合数据集；15×混合数据集的fFNR最高，而更高深度（45×、60×、75×）的混合数据集具有最低的fFNR，表明增加测序深度直接增强了变异检测的敏感性。

尽管目前已有很多非模式物种的DNM率估算数据，但鱼类仅有14个估算值，其中许多基于相当少量的突变。本研究在鳅家系中鉴定了26个DNM，生殖系突变率为5.23×10^-9 /bp/代，相对于其他鱼类生殖系突变率估算值处于中等水平。然而，鉴于其他研究中很少使用Sanger测序验证DNM，且使用了不同的变异检测流程，难以确定本估算值相对于已发表估算值的真实定位。

最后，研究中观察到的异常转换/颠换比值不太可能归因于较少的亲子三代家系数量（n=6）和筛选的突变数量（n=26），或SNP calling的问题。研究人员筛选了另一个具有13个亲子三代家系和44个突变的家庭，使用SRS数据观察到非常相似的转换/颠换比值（0.913，补充材料），这表明低比值可能是该物种的特异性特征。事实上，两个太平洋鲑鱼物种也观察到了类似的低比值（0.95-0.98）。

**研究结论**：基于本研究发现，非模式物种的DNM率准确估算仍然是复杂的挑战，受多种因素影响。仅依赖生物信息学验证倾向于因假阳性而高估突变率，强调了Sanger测序等额外验证的重要性。测序深度在降低假阴性率和假阳性率方面发挥重要作用。在将这些估算真正用于种群遗传学研究之前，需要对非模式物种已发表的DNM率估算进行进一步验证。