组成性过表达人P301L MAPT（微管相关蛋白tau）小鼠模型中显著的tau蛋白病及记忆缺陷

《Neurobiology of Disease》：Robust tauopathy and memory deficits in a mouse model constitutively overexpressing human P301L MAPT

　　

摘要：MAPT（微管相关蛋白tau编码基因）突变可导致额颞叶变性（FTLD-tau）。表达致病性MAPT等位基因的预临床小鼠模型已成功模拟了与人FTLD-tau相似的生化及神经病理现象。其中rTg4510模型在前脑特异性Tet-off系统调控下表达P301L人tau，但许多实验无需时序调控，而双基因Tet-off系统增加了简单转基因的成本、遗传变异及动物用量。研究人员构建并表征了在CaMKII启动子驱动下组成性过表达P301L人tau的小鼠。首建鼠及其子代于FVB/N背景中获得稳定表达0N4R亚型P301L人tau且水平与rTg4510相当的组成性"cTauP301L"小鼠品系。该品系在转基因插入位点存在较小缺失且无显著运动表型。但FVB背景出现意外的早期高死亡率，与C57BL/6小鼠回交一代后即缓解。两种背景下TauP301L表达均导致年龄依赖性tau积聚及胶质增生，主要见于前脑和海马。F1 B6/FVB转基因小鼠6月龄可检测到空间记忆缺陷。综上，新型cTauP301L模型重现了疾病相关病理及记忆缺陷，小鼠基因组干扰有限且无寿命限制性运动表型，是现有tau蛋白病小鼠模型的稳健替代方案。

论文解读：组成性过表达人P301L MAPT小鼠模型中显著的tau蛋白病及记忆缺陷

《Neurobiology of Disease》发表的本研究针对现有tau蛋白病（tauopathy）转基因小鼠模型存在的局限性——rTg4510模型为双基因Tet-off系统，成本高且插入导致244 kb Fgf14基因缺失可能干扰表型解读；PS19及JNPL3模型存在~249 kb染色体缺失及7–10月龄出现后肢瘫痪限制实验窗口；敲入（knock-in）模型病理出现过晚或过轻——研究人员构建了单一转基因、CaMKIIα启动子驱动人0N4R MAPT P301L（P301L人tau蛋白编码基因）的组成性过表达小鼠（cTau^P301L），对其进行了生化、组织病理、行为学全面表征，并与经典模型比较，旨在提供更简洁、基因组干扰小、无早发运动障碍的tau蛋白病临床前替代模型。

主要关键技术方法

研究人员采用Jackson Laboratory原核显微注射CaMKII–0N4R MAPT P301L构建物至FVB/NJ受精卵获得首建鼠，通过靶向基因座扩增（Targeted Locus Amplification, TLA）鉴定插入位点及缺失，PCR基因分型；部分小鼠与C57BL/6J回交获F1背景。脑匀浆生化分级（缓冲液可溶S1组分及十二烷基肌酸钠不溶P3组分）后经Western blot检测总tau（T46抗体）及磷酸化tau（PHF1检测pSer396/pSer404，AT8检测pSer202/pThr205）；石蜡切片进行磷酸化tau（PHF1、AT8）、错折叠tau（MC1）、星形胶质细胞（GFAP）、小胶质细胞（IBA1、CD68）免疫组化（IHC）及Gallyas银染观察神经原纤维缠结（NFT）；RNAscope原位杂交检测人MAPT转录本；扩张显微镜（Expansion Microscopy, ExM）观察纳米级tau纤维；B6/FVB F1背景cTau^P301L及非转基因（nTg）同窝鼠进行高架十字迷宫（EPM）、SHIRPA体表反射筛查、Y迷宫自发交替（Y-Maze Spontaneous Alternation, Y-MSA）及Morris水迷宫（Morris Water Maze, MWM）空间参照记忆版本与可视平台版本行为学测试，统计学分析采用ANOVA及非参数检验。

3.1. Generation of a cTau^P301Lmouse（cTau^P301L小鼠的构建）

通过原核显微注射获得多个人tau P301L过表达首建系，筛选脑内可溶性tau水平与2月龄rTg4510相近的412,677系（约内源小鼠tau的11倍，rTg4510约12倍，无统计学差异）。TLA显示转基因插入小鼠10号染色体，引起4.6 kb缺失且不破坏任何已知基因。RNAscope证实人MAPT转录本广泛分布于前脑、海马CA区、嗅球等神经元，外周组织（心肝脾肾等）未见明显表达，脊髓有低水平表达。选定412,677为研究品系。

3.2. Longitudinal biochemical characterization of cTau^P301Lmouse brain（cTau^P301L小鼠脑内tau的纵向生化表征）

对2、4、8、12月龄脑匀浆分馏Western blot显示：可溶组分总tau（T46）在8、12月龄较2月龄轻度下降，磷酸化tau（PHF1、AT8）随龄增加；不溶（sarkosyl-insoluble）组分中总tau及磷酸化tau在2、4月龄几乎检测不到，8月龄显著升高并持续至12月龄。表明cTau^P301L脑内tau在4–8月龄间发生向不溶性聚集态的转变，与人tau蛋白病生化演变相似。

3.3. Neuronal tangle pathology is observed in the cortex and hippocampus of the cTau^P301Lmouse at 8 months of age（cTau^P301L小鼠8月龄皮层及海马可见神经元缠结病理）

PHF1、AT8、MC1 IHC及Gallyas银染显示：4月龄仅有弥散胞质染色；8月龄皮层（尤其Ⅱ/Ⅲ层）及海马CA1区出现明确的NFT样胞质包涵体，Gallyas阳性；12月龄病理负荷进一步加重，部分动物CA1显示神经元丢失伴银染减少。扩张显微镜可分辨AT8阳性纤维状结构定位于神经元（IBA1不共标）。提示cTau^P301L可重现年龄依赖性NFT样病理。

3.4. cTau^P301Lbrains demonstrate age-dependent gliosis（cTau^P301L脑呈现年龄依赖性胶质增生）

GFAP（星形胶质细胞标记）、IBA1（小胶质细胞标记）及CD68 IHC显示：8、12月龄转基因鼠皮层及海马GFAP⁺、IBA1⁺面积占比显著高于2、4月龄及同龄nTg（p<0.01），与NFT分布时空重合。证实伴随tau聚集出现继发性反应性胶质增生。

3.5. Early mortality of mice on FVB background versus B6 background（FVB背景早期死亡 vs B6背景）

纯FVB背景cTau^P301L雌鼠32/47、雄鼠38/53于4–12月龄突发死亡（nTg同窝也有但率低），推测与FVB品系癫痫易感相关。与C57BL/6J回交F1代cTau^P301L雄鼠32/32、雌鼠28/29存活至8–12月龄无猝死，且8月龄脑内PHF1/E1病理仍保留。因此推荐B6背景或回交背景开展长期研究（Jackson Lab Stock #041448）。

3.6. cTau^P301Lmice show impairment in acquisition and retention of spatial reference memory（cTau^P301L小鼠空间参照记忆习得与保持受损）

EPM及SHIRPA显示cTau^P301L与nTg焦虑水平、反射、步态、一般活动无差异；Y迷宫自发交替率相近（~70%）。MWM训练期cTau^P301L逃逸路径更长（p<0.001），更多沿壁游泳（thigmotaxis, p<0.001）；探针 trial中平台区穿越次数均值≈1次（nTg≈4.5次，p<0.001），可视平台测试中仍表现较多缘周游泳策略，排除运动/视力因素后确认海马依赖的空间参照记忆缺陷始于6–8月龄。

3.7. Consideration of sex as a biological variable in the cTau^P301Lmouse（性别作为生物学变量的考量）

生化上可溶tau无性别差异；不溶tau在12月龄雌性略高于雄性（AT8、E1抗体检测）。行为学上MWM缘周游泳比例及可视平台穿越有轻微性别交互，总体认知缺陷不受性别显著影响。

讨论与结论

研究人员指出cTau^P301L模型为单转基因、CaMKIIα驱动组成性过表达人0N4R MAPT P301L，插入致4.6 kb无功能基因缺失（远小于rTg4510的244 kb Fgf14缺失及PS19的249 kb缺失），脑内人tau水平与rTg4510相当。该模型在B6/FVB背景下8月龄出现不溶性磷酸化tau沉积、NFT样病理（PHF1/AT8/MC1⁺、Gallyas⁺）及伴随的皮层/海马胶质增生（GFAP/IBA1/CD68），6月龄起出现海马依赖的空间参照记忆缺陷（MWM），无显著运动障碍或早发后肢瘫痪，纯FVB背景早期猝死可被C57BL/6J回交消除。该模型提供≤4月龄病理前的干预窗口及8月龄稳定病理表型，是比rTg4510（双基因、大片段缺失）和PS19/JNPL3（运动表型限制窗口）更简便、基因组干扰更小的tau蛋白病临床前替代模型，适用于抗tau治疗临床前评价。

翻译研究结论部分：cTau^P301L小鼠经传统转基因构建，在10号染色体整合单一CaMKII–hTau^P301L转录单元并产生不破坏已知基因的4.6 kb缺失。人P301L tau在前脑神经元广泛表达，水平近似rTg4510。胞质AT8/PHF1磷酸化tau积聚及银亲和性NFT样结构于8月龄出现在皮层与海马，不溶tau组分同步升高，并伴皮层（8月龄）及海马（12月龄）星形胶质与小胶质增生。B6/FVB F1背景cTau^P301L小鼠6–8月龄出现Morris水迷宫空间参照记忆缺陷，无运动异常。FVB背景早期猝死经C57BL/6J回交消除且病理保留。综上，cTau^P301L重现年龄依赖性tau聚集、NFT病理、胶质增生及记忆损害，基因组干扰小、无非tau相关运动表型限制，是tau蛋白病体内研究的稳健替代模型，适合tau靶向治疗评价。