延髓5-羟色胺能神经元与逆 trapezoid 核(retrotrapezoid nucleus, RTN)神经元急性分离后的固有pH化学敏感性

《The Journal of Physiology》：Intrinsic pH chemosensitivity of acutely dissociated medullary serotonergic and retrotrapezoid neurones

　　

中枢呼吸化学感受器(central respiratory chemoreceptors, CRCs)对于维持正常的全身pH和PCO2水平至关重要，其具体身份尚存争议。学界普遍认为CRC必须能通过细胞自主(固有,intrinsic)机制响应微小的pH变化，但多数旨在鉴定CRC的研究仅阻断了有限的突触机制。研究人员采用膜片钳记录比较了两类CRC候选细胞的化学敏感性：(1) 表达Phox2b的逆trapezoid核(retrotrapezoid nucleus, RTN)神经元；(2) 延髓中缝核产生5-羟色胺(serotonin, 5-HT)的神经元。研究人员利用急性分离(acute dissociation)确保反应为固有性质。当CO2从5%升至9%(pH 7.4至≈7.2)时，48%的延髓5-HT神经元(n= 118)放电频率增加超过20%，平均增幅139%；而仅16%的RTN神经元(n= 93)放电频率增加超过20%，平均增幅46%。表达神经介素B(Neuromedin B, Nmb， proposed RTN CRCs生物标志物)的RTN神经元并未更可能出现较大的pH反应。培养3天后，许多RTN神经元开始接受来自5-HT神经元的兴奋性突触驱动并对酸中毒产生反应。结果表明延髓5-HT神经元亚群是CRC。多数RTN神经元可能参与整合与传递来自5-HT神经元及其他化学感受位点的pH信息，但直接感受pH的作用较小。

本文发表于The Journal of Physiology，研究背景如下：中枢呼吸化学感受器(central respiratory chemoreceptor, CRC)是脑干内检测生理范围内P_CO2和/或pH扰动并启动通气变化以恢复酸碱稳态的特化神经元和/或胶质细胞，其细胞身份长期存在争议。两个主要的CRC候选者是：延髓腹外侧喙部(retrotrapezoid nucleus, RTN)表达Phox2b的神经元，以及延髓中缝核(raphe nuclei)产生5-羟色胺(serotonin, 5-HT)的神经元。CRC必须具备细胞自主（即固有,intrinsic）的CO₂/pH响应能力，但既往脑片研究多采用部分谷氨酸、GABA、甘氨酸及P2X受体拮抗剂或低钙/河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)处理，无法完全排除递质释放（如转运体逆向转运、单胺及肽类递质作用）带来的间接影响，因此既往观察到的RTN神经元高反应性可能掺杂了显著的突触输入成分。为彻底排除外在突触影响，研究人员采用急性酶解分离(acute dissociation)后全细胞记录的方法，直接对比RTN与5-HT神经元对生理性及病理性pH变化的固有(intrinsic)化学敏感性，并探讨两者间的突触联系。

主要关键技术方法

研究人员使用转基因小鼠：RTN神经元取自Phox2b-Cre; ROSA26-tdTomato; ChAT-GFP三阳性小鼠，鉴定为tdTomato阳性且GFP阴性（ChAT^?）；5-HT神经元取自ePet-EYFP（Pet1阳性）及Tph2-ChR2-EYFP小鼠。取P6–P10（RTN）或P11–P16（5-HT）新生小鼠脑干相应区域，木瓜蛋白酶(papain)消化后急性机械离散，接种于包被多聚赖氨酸的载玻片，24–48小时内进行穿孔膜片钳(perforated-patch)电流钳记录。灌流人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, aCSF)分别用5% CO₂(pH≈7.4)和9% CO₂(pH≈7.2)诱导呼吸性酸中毒，或HEPES缓冲液进行等碳酸性(isocapnic)pH 8.0?7.0切换。部分RTN神经元行RNAScope原位杂交检测Nmb表达。共培养实验中混合RTN与Tph2-ChR2-EYFP 5-HT神经元，培养数天至数周后光刺激(optogenetic stimulation)5-HT神经元并记录RTN神经元反应，使用5-HT₇受体拮抗剂SB269970验证突触传递。

研究结果

Response of acutely dissociated 5-HT and RTN neurones to hypercapnic acidosis（急性分离的5-HT与RTN神经元对高碳酸性酸中毒的反应）

CO₂由5%增至9%（pH 7.4→≈7.2）时，118个5-HT神经元中48%（57/118）放电频率增加>20%，平均增幅139%；93个RTN（Phox2b⁺/ChAT^?）神经元中仅16%（15/93）增加>20%，平均增幅46%，且反应较迟缓、重现性差。5-HT组与RTN组的反应分布差异具统计学意义（Mann–Whitney U检验, P< 0.0001）。表明生理范围内5-HT神经元具显著固有化学敏感性，RTN神经元固有敏感性很弱。

A subset of RTN and 5-HT neurones were stimulated by pathological isocapnic changes in pH（RTN与5-HT神经元亚群可被病理性等碳酸性pH变化刺激）

等碳酸性pH由8.0降至7.0时，61个5-HT神经元中70%（43/61）放电增加>50%；164个RTN神经元中23%（38/164）增加>50%。差异仍显著（P< 0.0001）。即便用大pH跨度刺激，RTN神经元固有反应仍远弱于5-HT神经元。

Chemosensitivity is not more common in RTN neurones that express Neuromedin B（表达神经介素B的RTN神经元并不更具化学敏感性）

对39个RTN神经元行NmbRNAScope分型（阴性、低-中度1+/2+、高度3+），发现呼吸性酸中毒及等碳酸性酸中毒反应与Nmb表达强度无相关性（Kruskal–Wallis, P=0.171及0.462）。不同解剖切取方式（水平vs斜角）所获RTN神经元化学敏感性也无差异。提示Nmb并非RTN固有CRC的生物标志物。

Quantification of chemosensitivity by calculating absolute firing rate（以绝对放电频率量化化学敏感性）

全部RTN神经元在5%与9% CO₂下平均放电率分别为2.97±1.95 Hz与3.03±2.05 Hz（P=0.380），无显著变化；全部5-HT神经元分别为1.31±0.80 Hz与1.81±1.27 Hz（P< 0.0001）。低-中度Nmb⁺RTN神经元也无显著变化，而化学敏感性最强的前20%–50% 5-HT神经元对高碳酸性酸中毒表现出具有生理意义的放电增幅。

RTN neurones developed increased chemosensitivity with time after acute dissociation due to formation of excitatory connections from 5-HT neurones（RTN神经元在急性分离后因形成来自5-HT神经元的兴奋性连接而随时间获得增强的化学敏感性）

分离后第1天RTN神经元几无强酸化反应；培养3–5天后部分RTN神经元出现大幅酸化反应（P=0.0231 vs 1–2天）。5-HT神经元各时间点均保持强固有敏感性。共培养RTN与Tph2-ChR2-EYFP 5-HT神经元，蓝光刺激5-HT神经元可引发RTN神经元爆发式动作电位，该反应被5-HT₇受体拮抗剂SB269970阻断并可洗脱恢复（Friedman检验, P=0.0003）。酸化的RTN神经元更易被光刺激激活（Spearman相关, P< 0.0001）。证实RTN神经元在完整或重建网络中出现的"化学敏感性"部分源于5-HT神经元经由5-HT₇受体的兴奋性突触驱动。

讨论与结论翻译

讨论指出，本研究通过彻底排除突触影响的急性分离模型证明：相当比例的延髓5-HT神经元具备对生理性pH变化的快速、大幅、固有(intrinsic)兴奋反应，符合CRC标准；而绝大多数RTN（含Nmb⁺）神经元缺乏此类固有敏感性，其在体/脑片中的高碳酸反应主要依赖来自5-HT神经元及其他化学感受位点的突触输入。RTN神经元可能在呼吸节律生成及整合传递化学感受信息至呼吸网络中发挥作用，而非直接的pH传感器。Nmb、Gpr4、Kcnk5等分子是RTN神经元特征标记，但不介导固有pH感受功能。5-HT对RTN的兴奋作用可通过G蛋白偶联受体（5-HT₇）实现快速突触传递。综上，延髓5-HT神经元亚群是主要的中枢呼吸化学感受器；RTN神经元更多作为化学感受信息的整合器与中继站。