《The Journal of Physiology》：Transcutaneous auricular vagus nerve stimulation during short-term motor practice drives cortical plasticity without behavioural improvement
经皮耳迷走神经刺激（taVNS）正作为一种有前景的非侵入性神经调控技术用于促进神经康复；然而，其在人体中的作用机制仍知之甚少。动物研究表明，运动技能练习期间施加的迷走神经刺激（VNS）可驱动初级运动皮层（M1）的任务特异性可塑性，但直接的人体证据有限。在此，研究人员证明，与灵巧运动技能练习配对的taVNS可选择性增强皮层可塑性，但在短期训练期间不提升运动表现。31名健康成人进行了15分钟的双球旋转任务练习。参与者被随机分配在练习期间接受左侧耳屏taVNS或假刺激。在练习前后评估了运动表现、M1表征（经颅磁刺激映射）和脊髓兴奋性（F波），同时在练习期间监测瞳孔直径。两组的运动表现均相似改善，而taVNS组的皮层图谱扩展显著大于假刺激组。假刺激组的F波振幅增加，而taVNS组未增加，这提示当训练与taVNS配对时，练习相关可塑性的表达相对转向皮层回路。这一模式表明taVNS可能影响运动可塑性的层级表达。此外，taVNS在练习期间诱发瞳孔扩张，与去甲肾上腺素能系统参与一致。这些发现表明，taVNS独立于即时行为改善而促进人类的任务特异性皮层重组。通过将taVNS诱导的可塑性与去甲肾上腺素能参与相关联，并揭示皮层和脊髓的差异性反应，本研究为taVNS与运动训练配对如何建立运动恢复的神经基础提供了新的机制性见解。
神经可塑性的增强是促进神经康复和运动技能习得的关键策略。迷走神经刺激（VNS）在增强运动恢复方面显示出潜力，这得到了动物模型和脑卒中患者临床试验的支持。经皮耳VNS（taVNS）为侵入性VNS提供了一种非侵入性且安全的替代方案，因此吸引了日益增长的治疗关注。然而，taVNS的治疗机制仍不清楚。目前尚无研究表明taVNS能改善健全个体的灵巧运动技能。动物研究表明，在灵巧运动训练期间施加的侵入性VNS以任务依赖性方式诱导初级运动皮层（M1）表征的可塑性变化。因此，将taVNS与运动技能训练配对可能促进支配任务相关肌肉的运动相关神经环路的可塑性变化。在人体中，在未进行运动任务的情况下检验taVNS对M1兴奋性或抑制性影响的研究结果不一致。值得注意的是，尚无研究评估taVNS后M1图谱表征的可塑性变化。由于M1神经元通过皮质脊髓通路投射至脊髓运动神经元，M1的激活甚至亚阈值可塑性变化也可能影响脊髓兴奋性。事实上，M1上的非侵入性刺激已被证明不仅能调节皮层兴奋性，还能调节脊髓回路。自主运动执行依赖于对脊髓运动神经元兴奋性的调节；因此，运动学习期间施加的taVNS可能影响皮层和脊髓运动神经元。然而，taVNS对脊髓运动神经元兴奋性的影响尚未被探索。为分离运动神经元池水平的可能变化，同时将传入通路或下行皮质脊髓驱动的贡献降至最小，研究人员将F波作为脊髓运动神经元兴奋性的指标进行评估。F波主要通过逆向激活和α运动神经元的回返放电来反映运动神经元兴奋性。据研究人员所知，taVNS对脊髓运动神经元兴奋性的影响尚未被系统研究。此外，这一方法使研究人员能够在同一实验框架内检验皮层和脊髓水平的可塑性变化。
taVNS也被证明可调节自主神经和觉醒系统。研究表明，静息状态下的taVNS激活蓝斑-去甲肾上腺素（LC-NA）系统，这通过瞳孔扩张反映出来，瞳孔扩张已被广泛用作LC-NA活动的非侵入性替代指标。然而，大多数将taVNS与LC-NA激活联系起来的证据是在静息条件下获得的。由于运动行为本身会调节觉醒和去甲肾上腺素能活动，在持续运动行为期间施加的taVNS是否激活类似的神经调控机制仍不清楚。因此，监测taVNS配对灵巧运动学习期间的瞳孔动态可能为迷走神经刺激如何在运动行为期间与任务相关性去甲肾上腺素能调节相互作用提供有用的窗口。
先前在动物和人体中的工作都强调了刺激时机的重要性。在几项研究中，相位性VNS与离散运动如伸手、抓握和杠杆按压同时传递。一项动物研究进一步表明，当VNS在成功运动后立即传递时，可增强运动改善并选择性调节M1神经元。其他康复研究报告了无论精确时机如何taVNS都有有益效果，例如当静息状态下的连续taVNS与后续治疗结合时。因此，刺激时机的重要性仍未解决。此外，大多数研究采用离散任务，尚不清楚taVNS是否能影响周期性运动技能的学习。为解决这一差距，研究人员采用了周期性双球旋转任务，该任务需要顺序和协调的手指运动，并已被广泛用于运动学习范式。本技能的目标是尽可能快地旋转球，但即使慢速旋转也可视为成功运动。双球旋转练习期间的连续taVNS可视为与持续成功运动同时传递的刺激，类似于先前研究中与离散成功配对的相位特异性VNS。
研究人员研究了与周期性灵巧运动技能练习配对的taVNS对行为表现和运动相关神经回路可塑性的影响。研究人员假设，运动练习期间的taVNS可促进运动学习、扩展任务相关肌肉的M1表征并增加脊髓运动神经元兴奋性，可能通过LC-NA系统参与实现。
本研究经早稻田大学人类研究伦理委员会批准（批准号：2020-93），所有参与者均签署书面知情同意书。研究符合《赫尔辛基宣言》标准，但因非临床试验而未在数据库中注册。
31名健康右利手成人参与了本实验。参与者被伪随机分配至taVNS组（n=16；23±4岁；3名女性和13名男性）或假刺激组（n=15；22±5岁；4名女性和11名男性）。利手性通过爱丁堡利手量表确认，偏手指数范围为68.4至100（均值±标准差：93.7±10.2）。所有参与者均无双球旋转任务的先前经验。
本研究采用随机、单盲、假刺激对照设计。两组参与者均被告知将经耳电极传递电刺激，但电流可能太弱而无法感知。因此，所有参与者都相信他们接受的是真实刺激，无论分组如何。由于刺激器不包含假刺激模式，且实验者手动调节刺激强度，实验者未被设盲。
实验流程对两组相同，区别在于练习期间耳电极上有无电刺激（taVNS组）或无有电刺激（假刺激组）。参与者用左手进行双球旋转任务，包括30次练习试次（10次试次×3组）。练习期间，taVNS或假刺激施加于耳屏。行为表现和神经生理学评估在练习前后（前测和后测）进行，此时不佩戴taVNS电极。每次实验约持续3小时。
为靶向迷走神经的传入耳支，刺激电极（RELIfit-Tragus，Soterix Medical Inc.）通过钩挂装置固定于左耳，电极尖端置于耳屏。位置调整以最大化感知强度并用医用胶带固定。放置前用酒精棉清洁耳屏周围皮肤。选择耳屏是因为其被认为是迷走神经调节的合适部位。
刺激使用专用设备（0125tA，Soterix Medical Inc.）传递，参数基于先前研究：30 Hz频率，300 μs脉宽，总时长900秒（30个30秒开和30秒关的周期）。电流强度设定为个体痛阈或低0.5 mA，因为设备仅允许0.5 mA增量。如果痛阈强度的刺激被报告为"不可耐受"，强度降低0.5 mA，这在所有参与者中仍超过感知阈值。平均刺激强度为2.37±1.41 mA。对于假刺激，一些先前研究将电流施加于耳垂，该区域无迷走神经支配。然而，由于耳垂刺激仍可能影响运动相关脑功能，研究人员采用电极置于相同耳屏位置的无电流假刺激条件，与其他研究一致。因此，假刺激组未进行强度调节。无参与者报告头痛等不良效应。
参与者用左手练习周期性双球旋转任务。参与者坐在桌前，尽可能快地顺时针旋转置于左手掌中的两个高尔夫球（直径33 mm，各45 g）。球被涂成黄色和白色以便于后续视频分析跟踪。参与者被指导保持视线使左手和显示任务指令的监视器均在视野范围内。如果球掉落，参与者被指示立即捡起并继续任务。
在前测和后测中，参与者进行两次30秒的顺时针（CW）旋转试次和两次30秒的非练习逆时针（CCW）旋转试次，均尽可能快速完成。无论测试或练习，每个30秒的运动任务前后均有30秒的休息期，无练习或刺激。一次练习组包括10次交替的30秒练习和30秒休息。参与者共完成三组，组间休息由个体决定（通常1-2分钟）。任务指令、试次时间和经过时间在监视器上显示以确保参与者间练习标准化。
行为评估使用安装于三脚架上方的网络摄像头以60 fps记录。视频数据使用DeepLabCut分析，这是一个基于深度神经网络的开源无标记姿势估计工具箱。追踪球的y轴位移用于在MATLAB中计算两个参数：旋转次数（通过峰值周期计数确定）和旋转不稳定性（以周期长度标准差量化）。
肌电图（EMG）信号记录自左侧拇短展肌（APB）和第一骨间背侧肌（FDI），使用双极Ag/AgCl表面电极。EMG信号经放大、带通滤波（5-1500 Hz）并以4000 Hz数字化，用于运动诱发电位（MEP）和F波记录。单脉冲单相经颅磁刺激（TMS）通过70 mm蝶形线圈以Magstim 200传递。参与者舒适就座，在整个测量过程中保持放松。
线圈置于引发APB最大MEP的位置，该位点被 designated 为热点。静息运动阈值（RMT）定义为在APB中10次试次至少5次诱发>0.05 mV MEP的最低TMS强度。
然后使用120% RMT强度在以热点为中心的11×11 cm网格（1 cm间距）内获取运动图谱。线圈位置通过导航系统持续监测。线圈方向相对于热点保持恒定，同时调整倾斜度以保持与头皮的切向接触。每个网格点每3-4秒传递3次TMS，由导航系统引导。选择这一刺激数量是为了最小化干预后评估的持续时间，因为诱导的可塑性时间稳定性未知。使用3次与5次刺激每个网格点的映射结果比较来验证3次刺激方案的有效性。映射从热点开始向外扩展。下一个刺激位点从尚未测试的活动点（平均APB MEP振幅>0.05 mV）的四个相邻位点中随机选择。平均APB MEP<0.05 mV的位点被定义为非活动位点。映射持续直到整个图谱被非活动位点包围。前测和后测均采用相同程序。所有TMS测量由同一实验者执行。
MEP振幅量化为TMS后20-50 ms窗口内的峰峰值。运动图谱特征以两种方式评估：图谱大小，定义为活动位点数量，反映表征的空间范围；图谱容积，定义为所有活动位点平均MEP振幅之和，提供皮层表征整体兴奋性的信息。
F波被广泛用作脊髓运动神经元池兴奋性的指标，因为它们反映α运动神经元的逆向激活和回返放电，不涉及感觉传入的突触传递。F波通过对腕部近端约8 cm处正中神经的电刺激诱发，使用3.2 cm圆形电极（阴极远端，阳极近端）连接恒流刺激器。电极间距约5 cm。放置电极前，用探针电极确定最优刺激位点，即产生APB和FDI肌肉清晰M波的位置。参与者舒适就座，左手旋前置于桌上。
每次测试（前测和后测）中，以诱发APB最大M波振幅（M-max）所需强度的120%传递20次刺激（200 μs脉宽），频率0.5 Hz。taVNS组一名参与者因疼痛不耐受未进行F波测量。
F波分析中，额外应用25 Hz高通滤波以抑制前导M波的拖尾。由于F波潜伏期在不同和同一参与者间均有变异，峰峰值振幅的分析窗口通过目视检查为每次试次个体化调整。脊髓兴奋性以两个参数评估：F波持续性，定义为20次刺激中可检测F波的百分比（检测阈值：0.03 mV）；F波振幅，定义为可检测F波的平均峰峰值振幅归一化至M-max（F/M比值）。如果20次试次中未检测到F波，该参与者的振幅数据排除于统计分析之外。
行为、MEP和F波的统计分析采用Shapiro-Wilk检验评估数据正态性。确认正态性后，进行双因素重复测量方差分析（ANOVA）（组[taVNS，假刺激]×时间[前测，后测]）。发现显著交互作用时，进行事后检验：组间比较使用Student非配对t检验，组内比较使用配对t检验。对于四重比较，使用Bonferroni校正将显著性水平调整至P<0.0125。违反正态性时，应用非参数检验（组间比较Mann-Whitney U检验，组内比较Wilcoxon符号秩检验）。
此外，计算从前测到后测的变化幅度（Δ）值。Δ值的组间比较使用非配对t检验（正态分布数据）或Mann-Whitney U检验（非正态数据）。组内Δ值与零的比较使用单样本t检验（参数）或Wilcoxon符号秩检验（非参数）。Δ值分析显著性设定为P<0.05。
练习期间（任务和休息期），以120 Hz从左眼记录瞳孔直径，使用眼动追踪仪。追踪仪在第一组练习前安装，最后一组后移除。所有记录在同一实验房间进行，稳定人工照明条件，无外部光源，确保各次会话和参与者间照明一致。
瞳孔数据在MATLAB R2021a中按Kret与Sjak-Shie的指南预处理。仅保留置信度值≥0.7的样本。丢弃1.5-9 mm生理合理范围外的值。眨眼相关伪迹通过瞳孔信号一阶导数（扩张速度）识别。表现出中位数+3中位数绝对偏差（MAD）的样本被分类为伪迹，并额外移除前后100 ms（三个样本）以捕捉完整眨眼。连续间隙>75 ms的向每侧扩展50 ms。进一步噪声伪迹通过比较原始信号与移动平均平滑版本检测；>3 MAD的偏差被排除。缺失数据仅对≤0.5 s的间隙进行线性插值。结果信号重采样至30 Hz并以零相位低通Butterworth滤波器（4 Hz截止）平滑。
数据分割为任务期和休息期。每期瞳孔直径以任务/休息切换前0.2 s平均值基线校正，并以百分比变化表示。每个参与者的30个任务或休息期的值取平均。
瞳孔直径时间序列差异使用一维数据统计参数映射（SPM1D）检验。对每个条件进行单样本t检验对比基线（0）。配对t检验比较每组内任务与休息，非配对t检验比较相同条件下taVNS组与假刺激组。每个时间点计算t值和P值，显著性设定为α=0.05（双尾）。为确保生理学相关性，仅考虑>3个连续时间点（30 Hz时>0.1 s）超过临界阈值的簇。分析限制于30秒试次的0.2-25.0 s，排除前0.2 s（瞳孔反应潜伏期）和最后5 s（因关注计时器或任务完成的预期效应）。此外，比较组间瞳孔大小变化速度以评估潜在的反应动态差异。作为对照分析，使用非配对t检验比较组间各期（任务和休息）的绝对基线瞳孔直径，以确认基线差异的缺失。因眼动追踪仪故障排除两名参与者（taVNS组：n=1，假刺激组：n=1）。
两组在双球旋转表现上均显著改善，但taVNS未提供额外的行为收益。因此，研究人员的假设在行为层面未获支持。一种可能的解释是干预的短暂性：仅有15分钟的练习伴随刺激。相比之下，显示脑卒中患者功能收益的临床研究通常涉及数天至数周的干预期。研究人员的发现提示，当前方案足以诱导神经可塑性但不足以驱动行为收益。与研究发现一致，一项动物研究报告VNS配对运动训练诱导M1图谱扩展而无并行表现收益，意味着皮层重组和行为改善可能发生在不同时间尺度。更长的干预可能揭示行为收益，因为许多显示VNS功能改善的研究采用了持续数天至数周的训练方案。
第二种可能是连续球旋转任务未提供明确的成功信号，不同于VNS与离散、奖赏运动配对的范式。尽管每次旋转技术上可视为成功，参与者可能未感知试次间结果，这可能减少奖赏相关神经调控回路的参与。动机和任务显著性（通常在康复或动物模型中较高）在此可能相对较低，减弱了taVNS的神经调控影响。
或者，taVNS对运动学习的影响可能取决于运动任务类型。本研究中使用了熟练连续任务（双球旋转），但近期研究报告taVNS促进了力场学习范式中的运动适应。值得注意的是，力场适应严重依赖小脑功能，而taVNS已被证明激活人体小脑。这提示taVNS可能增强小脑依赖性学习过程的可行机制。另一关键区别在于与不同任务类型相关的可塑性位点。运动适应被认为主要涉及小脑和皮层机制，尽管脊髓回路的相对贡献可能因具体任务和训练条件而异。事实上，研究人员的结果提示双球旋转任务涉及脊髓可塑性，如训练后假刺激组F波振幅增加所示。尽管受迷走神经传入影响的脑干核团拥有至脊髓的下行投射，taVNS主要激活脊髓上神经调控系统。因此，本任务中可塑性的表达可能偏向脊髓上回路，这可以部分解释该任务中观察到的有限行为收益。综合来看，这些发现暗示taVNS可能对依赖小脑或皮层可塑性的任务更有效而非脊髓机制。未来研究应系统比较不同类型的运动学习以确定哪些最易受taVNS诱导行为增强的影响。
值得注意的是，仅taVNS组在非练习CCW条件中表现出稳定性改善。鉴于该组观察到更大的M1扩展，这一效应可能反映通过M1重组的泛化学习，与促进皮层内去抑制和运动泛化的报告一致。
研究人员的结果表明，与假刺激组相比，taVNS组M1表征扩展更大，如图谱大小和图谱容积的变化所反映，支持研究人员的皮层水平假设。这一发现与先前动物研究一致，并为taVNS可增强人体运动图谱可塑性的首个证据。值得注意的是，干预时长远短于先前动物或临床研究（从数天至数周不等），凸显了taVNS诱导快速皮层重组的效力，这对临床转化高度相关。假刺激组大多数M1参数未显著变化，除FDI图谱容积降低外。这可能反映神经效率，即支持改善技能执行的激活降低的一种皮层可塑性形式。因此，taVNS可能将可塑性转向表征扩大。目前尚不清楚这种扩展是否为肌肉特异性或更广泛，因仅检查了APB和FDI。
脊髓运动神经元兴奋性方面，假刺激组APB的F波振幅增加，表明脊髓水平的使用依赖性可塑性。此类脊髓适应已在周期性或姿势技能训练后报告，这些技能可在无意识情况下执行且脊髓贡献可能较离散运动更为显著。相比之下，练习与taVNS配对时未观察到此类脊髓水平变化。这些发现表明不同条件下练习相关可塑性的表达位点存在差异。
迷走神经传入投射至孤束核（NTS），其支配包括蓝斑（LC）和基底前脑在内的多个脑干核团，从而通过上行神经调控系统调节皮层可塑性。同时，LC神经元发送去甲肾上腺素能下行投射至脊髓，包括腹侧角和中间带，提示taVNS相关神经调控信号可能影响脊髓回路的潜在途径。此外，源自脑桥延髓网状结构的网状脊髓神经元投射至参与姿势和自主运动的脊髓中间神经元和运动神经元，已知有助于肌肉激活模式协调和自主运动期间下行运动命令的调节。这些路径可能影响自主任务期间脊髓运动系统的整体兴奋性状态，从而间接塑造脊髓可塑性的表达。因此，taVNS可能影响运动系统内可塑性表达的层级水平，跨越皮层和脊髓回路。
然而，在当前短期干预下，研究人员观察到皮层重组而taVNS组F波指标未检测到变化。综合来看，这些结果提示神经调控背景可能影响运动系统内可塑性表达的水平。即，本研究中单独运动练习可能导致运动神经元池水平可测量的适应，而将练习与taVNS配对可能与可塑性可测量表达向脊髓上回路的相对转移相关。关于可塑性可测量表达转移的解释应考虑本研究采用的简短干预背景，可能不扩展至其他taVNS范式。研究人员不排除额外脊髓机制被激活但未被F波测量捕捉的可能性。此外，应注意TMS映射和F波测量均提供神经可塑性的间接指标，无法最终定位底层突触机制。因此，关于可塑性层级位点的结论应谨慎解释。
若taVNS优先促进皮层可塑性，其治疗潜力可能取决于神经功能障碍的位点。这可能部分解释为何几项报告taVNS有益效果的临床研究见于涉及脊髓上功能障碍的疾病（如脑卒中），尽管需进一步工作以确定类似收益是否扩展至主要涉及脊髓病理的疾病。
据研究人员所知，本研究首次检验运动练习伴随taVNS期间的瞳孔动态。两组均显示任务相关瞳孔扩张相对于休息；然而，仅taVNS组在任务开始后立即表现出快速显著的瞳孔扩张，且扩张速度快于假刺激组。瞳孔直径及其变化率是LC-NA系统活动的可靠标志物，因此这些结果指示taVNS下更强的去甲肾上腺素能参与。由于瞳孔大小也是认知状态如觉醒的替代指标，其受运动和运动学习期间LC-NA系统调节，taVNS参与者可能处于对任务更大的注意聚焦状态，这可能进而促成观察到的M1可塑性。
先前研究表明双球旋转任务涉及M1、前运动、辅助运动和小脑区域。同时，taVNS即使静息时也能激活LC和小脑，并调节小脑-丘脑-M1通路。因此，练习期间小脑回路与taVNS的联合激活可能通过LC-小脑-丘脑-M1通路促进M1重组。尽管短期练习不足以改善行为，更长干预可能强化小脑内部模型并促进学习。
分子水平上，VNS已被证明增强脑源性神经营养因子（BDNF）表达。近期动物工作表明taVNS同样通过胆碱能受体增加皮层BDNF，而人体研究提示taVNS的胆碱能募集。胆碱能系统已被确认为运动学习和M1表征可塑性扩展的关键介导者。此外，去甲肾上腺素能参与（如研究人员瞳孔发现所支持）可能至关重要。LC-NA和基底前脑胆碱能系统均接受NTS（迷走神经传入的第一级中继）的投射。因此，taVNS可能协同激活这些系统，导致神经调质和BDNF释放增加，从而促进M1可塑性。这些机制可能共同解释taVNS配对运动练习如何增强M1中的神经可塑性。
总之，与灵巧运动练习配对的taVNS未能在短期内增强运动学习，但选择性促进了M1图谱重组而无可检测的脊髓可塑性变化。瞳孔动态指示升高的去甲肾上腺素能参与，提示组间神经调控回路的差异募集。尽管短期内未显著促进行为改善，taVNS可能在结合长期训练时为长期功能恢复提供神经基础。这些发现凸显taVNS作为人体皮层可塑性选择性调节剂的作用，并支持其作为靶向神经康复辅助手段的潜力。
