利用ATR-FTIR与化学计量学方法对受损腐烂的皮肤组织进行时间与定性分析

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Temporal and qualitative analysis of injured decomposed skin tissues using ATR-FTIR combined with chemometrics

　　

郭博渊|胡庚光|卢浩哲|朱正阳|李志静|何文汉|习宁|楚罗克|魏震|郭志伟|曹倩|孙琴如

中国陕西省西安市西安交通大学法医学学院法医病理学系，邮编710061

摘要

在法医实践中，判断伤情发生时间以及区分生前伤与死后伤具有极为重要的意义；然而，随着尸体腐败程度的加深，传统方法的辨识能力会显著下降。本研究建立了兔子锐器伤模型，在死亡后1至7天内采集全层皮肤样本，运用衰减全反射-傅里叶变换红外光谱技术结合化学计量学方法，分析自然环境条件下表层受伤组织的生化变化。研究结果表明，1740 cm^?1、1650 cm^?1、1540 cm^?1以及1080–1030 cm^?1处的特征谱带分别对应脂质羰基、酰胺I、酰胺II以及磷酸/碳水化合物相关成分，这些谱带随死亡时间的延长而发生明显变化。通过对光谱数据进行主成分分析，可发现不同组别受伤组织生化成分存在随时间变化的规律。在六种机器学习回归模型中，偏最小二乘回归模型的预测效果最佳，其R²(Pred)值可达0.932；在三种分类模型中，偏最小二乘判别分析模型在区分腹部生前伤与死后伤方面表现最优，独立预测集的准确率为0.976。这些研究结果表明，结合化学计量学分析的ATR-FTIR光谱技术能够有效捕捉受伤组织的动态生化变化，有望为伤情发生时间的判断以及生前伤与死后伤的区分提供一种快速且无需标记的光谱分析方法。

引言

在法医工作中，判断伤情发生时间以及区分生前伤与死后伤对于还原死亡过程、明确案件真相至关重要[1]、[2]。在涉及暴力死亡、尸体转移或现场伪造的案件中，伤情的出现顺序及其发生在死亡之前还是之后，都可能直接影响死亡方式的判定以及法医证据的解读[3]。传统分析方法主要依赖于大体形态观察、常规组织学检查、组织化学检测以及免疫组织化学分析，这些方法大多以红细胞外渗、出血、炎症细胞浸润等形态学或组织学指标为依据[4]。随着法医研究的深入，相关的评估策略逐渐向多指标综合分析方向发展，重点关注CD14、CD32B、CD68[5]和α-SMA[6]等细胞标志物，VEGF[7]和TGF-β1[8]等生长因子，以及miRNA[9]和mRNA[10]等分子层面的变化。尽管这些方法在典型的新鲜损伤中仍具有一定的参考价值，但随着尸体腐败程度的增加，其有效性会显著下降。随着死亡时间的延长，组织自溶、分子降解以及结构破坏会进一步影响传统形态学特征和分子标志物的检测能力，从而大大增加判断伤情发生时间以及区分生前伤与死后伤的难度[11]、[12]。因此，有必要开发一种快速且客观的方法，能够在复杂的腐败环境下识别受伤组织的整体生化变化，为伤情时间判断以及生前伤与死后伤的区分提供更可靠的依据。

傅里叶变换红外光谱是一种基于分子振动特征吸收的快速分析技术，它能够在几乎不需要样品预处理且无需添加标记的情况下，同时获取蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物等多类生物分子的全面光谱信息[13]、[14]。尤其是1800–900 cm^?1范围内的“生化指纹区”含有大量生物大分子的特征谱带，对该区域而言，组织生化组成、分子构象以及代谢状态的变化都会引起明显的光谱变化[15]。由于检测速度快、样品消耗少、重复性好，且能与化学计量学建模方法相结合，ATR-FTIR特别适用于生物样本和法医样本的分析[16]。以往的研究表明，ATR-FTIR已被广泛用于体液鉴定[17]、[18]、死亡时间推断[19]以及死因分析[20]，显示出其在客观法医检验中的巨大应用潜力。傅里叶变换红外光谱结合化学计量学方法已被用于创伤性轴突损伤的伤情时间推断[21]，最近还被应用于腐败尸体的隐性脾脏损伤识别及伤情时间判断[22]，以及人类脑内血肿的存活时间分析[23]，这说明该技术能够捕捉受伤后组织变化的生化特征。此外，ATR-FTIR还被用于法医领域中血浆[24]、心包液[25]以及腐败脑组织[26]的死后变化分析。最近，Wójtowicz等人利用红外光谱技术，研究了在不同死亡时间以及尸体储存条件下的兔子玻璃体液、尿液及多个器官的死后生化变化，进一步证明了振动光谱技术在监测死后组织变化方面的价值[27]。这些研究表明，在死后过程中，脂质羰基区、酰胺区以及与碳水化合物/磷酸基团相关的低波数区域都会出现可检测的、系统性的变化。将这些光谱信息与主成分分析、偏最小二乘分析以及其他机器学习方法相结合，就可以构建出具有辨识和预测功能的模型[28]、[29]。

作为尸体表面最容易获取的组织之一，死后皮肤可能保留着与伤情、腐败过程以及个体特征相关的分子信息，因此在法医伤口鉴别、死亡时间推断以及个人身份识别方面具有重要价值。黄等人证明，傅里叶变换红外光谱技术能够区分小鼠皮肤上的生前伤与死后伤[30]，此外还利用基于偏最小二乘的模型，发现了大鼠背部皮肤在死亡过程中存在的规律性光谱变化[31]。张等人则利用傅里叶变换红外光谱技术及化学计量学方法，识别了腐败过程中的短暂性皮肤损伤[32]；Nteziryayo等人在模拟季节变化条件下，利用该技术区分了小鼠模型中的生前组、死后组以及无损伤组，其ROC AUC值均高于0.90[29]。不过，这些与伤情相关的研究主要依靠峰强度比较、传统统计学方法、主成分分析、偏最小二乘判别分析或ROC分析，尚未对多种监督式机器学习模型进行系统比较。邓等人将ATR-FTIR光谱技术结合多种机器学习算法，用于基于死后人类皮肤进行死亡时间推断[28]，但他们的研究未考虑伤情因素，而且人类样本往往存在更大的生物学差异性、可控性较低，且样本分布可能存在不平衡现象。总体来看，现有文献已经证明了基于皮肤的傅里叶变换红外/ATR-FTIR分析在法医领域的应用价值，但在结合生前/死后伤情对比、户外自然环境因素以及系统评估多种机器学习模型方面，仍存在明显不足。

为弥补这些缺陷，我们在中国西北部的户外野外环境中建立了兔子锐器伤模型，设置了三种样本类型：腹部生前伤、腹部死后伤以及头部死后伤。我们在死亡后1至7天内采集全层皮肤组织，利用ATR-FTIR技术获取组织的光谱信息。再结合主成分分析、偏最小二乘回归、支持向量机以及其他化学计量学和机器学习方法，系统分析了腐败过程中受伤组织的分子光谱变化。一方面，我们建立了与伤情发生时间相关的傅里叶变换红外光谱回归模型，并对比了不同算法的性能；另一方面，在控制解剖位置差异的基础上，验证了傅里叶变换红外光谱区分生前伤与死后伤的能力。本研究旨在为伤情发生时间的快速判断、微量样本分析以及无需标记的光谱检测方法的应用，以及生前伤与死后伤的客观区分提供新的思路。

章节节选

实验地点与环境条件

实验在中国西北部关中地区的一片开阔荒地中进行，具体位于陕西省咸阳市礼泉县关中环线附近（纬度约34.4°N，经度约108.4°E）。该地点远离居民区，没有人为干扰，地面主要是裸露的土壤，植被稀疏。该荒地的土壤属于沙壤土，主要的植被为Kochia scoparia（L.）Schrad.等植物。

环境条件

2025年8月15日至21日期间，我们对环境温度和相对湿度进行了连续监测并记录下来。每日平均温度在26.6℃至34.8℃之间，每日平均相对湿度则保持在55%–75%左右（见图S1）。在整个实验期间，环境条件相对稳定，为后续的形态学观察、光谱分析以及模型结果对比提供了可靠的基础。

伤情的形态学变化与TBS评分

见图1

结论

在本研究中，我们在户外野外环境中建立了兔子锐器伤模型，进而利用ATR-FTIR光谱技术结合化学计量学分析，研究了死后1至7天内受伤组织的生化变化规律。在1800–900 cm^?1的指纹区域内，1740 cm^?1处的脂质相关谱带先呈现上升趋势，随后下降，这表明早期会出现膜结构破坏和脂质释放，之后则会发生逐步的氧化和降解。酰胺I和酰胺II

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本项研究并未获得公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何资助。