《Nature Communications》：Probing the limits of genetic recoding using multi-omics-guided evolution
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摘要：通过重分配标准遗传密码中64个天然密码子里的多个密码子（即遗传密码工程），可使生物体获得全病毒抗性、阻止遗传信息交换及实现非天然聚合物的生物合成。然而，同义密码子替换——即重编码(Recoding)——常具致死性，且重编码如何影响适合度(Fitness)
摘要：通过重分配标准遗传密码中64个天然密码子里的多个密码子（即遗传密码工程），可使生物体获得全病毒抗性、阻止遗传信息交换及实现非天然聚合物的生物合成。然而，同义密码子替换——即重编码(Recoding)——常具致死性，且重编码如何影响适合度(Fitness)尚缺乏深入探究。本研究利用基因组合成、定向进化及基因组-转录组-翻译组-蛋白质组共分析(Co-profiling)，以多种合成大肠杆菌(Escherichia coli)基因组探究上述效应。研究人员构建了六株部分重编码大肠杆菌菌株，其合成基因组最高占比达45.8%，携带有害的57密码子遗传密码(57-codon Genetic Code)，共消除62,029个七类靶密码子实例。分析显示Syn61及Syn57中存在未分配密码子(Unassigned Codons)等广泛缺陷，研究人员遂应用多组学修订基因组设计并缓解缺陷。利用多组学，研究人员证实重编码诱导转录与翻译水平改变，导致数百种培养条件下适合度缺陷。最后，研究人员开发了多组学引导的进化策略(Multi-omics-guided Evolution Strategy)以快速恢复适合度，实现了具有激进改变的基因组合成。
论文解读：利用多组学引导进化探究大肠杆菌遗传密码重编码极限
研究背景与意义
遗传密码简并性允许通过同义密码子替换（即基因组重编码，Genomic Recoding）来重新设计生物体的遗传密码，从而构建基因组重编码生物(Genomically Recoded Organisms, GROs)，实现病毒抗性、阻断基因横向转移及拓展遗传编码能力。然而既往研究表明，即便是同义突变也可能引发生长缺陷甚至致死，且早期构建的Syn61Δ3等菌株存在严重适合度(Fitness)下降（倍增时间增加73%–153%）。限制激进密码子压缩（如57密码子基因组，Ec_Syn57）的主要障碍是：难以快速发现并调试合成基因组中密集分布的有害设计错误，以及对全基因组同义密码子改变带来的中心法则层级效应认识不足。本研究发表在《Nature Communications》，旨在开发基于多组学的合成基因组构建与调试技术SynOMICS，揭示同义重编码引起适合度下降的分子机制，并实现含57密码子遗传密码的大肠杆菌部分基因组合成。
主要关键技术方法
研究人员以大肠杆菌(Escherichia coli) MDS42野生型菌株为亲本，计算设计去除七种靶密码子（TAG终止密码子、AGA/AGG精氨酸密码子、TTG/TTA亮氨酸密码子、AGT/AGC丝氨酸密码子）并替换为同义密码子的Ec_Syn57全基因组序列，分88段合成于细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome, BAC)中。采用自主研发的SynOMICS（Synthetic genomes by multiomics-based iterative construction and troubleshooting）流程进行逐段替换：利用CRISPR/Cas9抗亲本序列的反向筛选在ΔrecA宿主中删除亲本染色体区段，结合Cappable-seq鉴定转录起始位点(Transcription Start Site, TSS)、Ribo-seq（核糖体图谱分析）检测翻译组与核糖体停滞、RNA-seq检测转录组、非靶向蛋白质组鉴定隐蔽开放阅读框(Cryptic ORFs)，发现设计缺陷；利用多重自动基因组工程(Multiplexed Autonomous Genome Engineering, MAGE)与DIvERGE（靶向诱变）纠正启动子/核糖体结合位点(Ribosome Binding Site, RBS)损伤及DNA合成错误；利用大种群规模（~10^12细胞/代）的适应性实验室进化(Adaptive Laboratory Evolution, ALE)恢复适合度。最终通过多组学引导的定向编辑与ALE修复重编码引起的全局基因表达失衡。
研究结果
Design and DNA synthesis for a radically recoded genome（激进重编码基因组的设计与DNA合成）
研究人员基于前期57密码子设计方案，解离重叠基因、消除直接重复与同聚物位点，完成全长4 Mbp基因组的162,521个碱基改变，将合成基因组分为88个~50 kbp区段克隆至BAC。合成流程使DNA合成错误率降低19倍。导入大肠杆菌时发现广泛插入序列(IS元件/Tn1000)易转座入合成片段，采用CRISPR/Cas9辅助MAGE剔除转位元件，完成88个BAC的制备。
Genome construction with frequent design issues（存在频繁设计问题的基因组构建）
为克服现有方法中缺乏针对亲本序列基于序列的反向筛选导致致死性重编码方案无法构建的问题，研究人员开发SynOMICS。该方法在ΔrecA宿主中用CRISPR/Cas9切割亲本同源臂强制置换为合成片段，使即便密集分布有害错误的区段也能暴露并调试。88段中19段单独无法支持生长。证明SynOMICS可处理此前REXER判定致死性的mraZ-ftsZ区段（含TTG/TTA亮氨酸密码子全消除），获得存活克隆，确认方法有效性。
Identification of lethal design issues（致死性设计问题的鉴定）
通过RBS Calculator预测翻译起始速率(Translation Initiation Rate, TIR)变化，发现36.3%基因TIR改变。利用Cappable-seq在全基因组范围鉴定活性启动子，发现Ec_Syn57中同义替换意外破坏生长必需基因（如accA、dnaT、msbA、ribF、rpsT）内部启动子（Intragenic Promoters），使其转录输出显著下降；这些受损启动子正位于无法单独替换的区段，证实启动子扰动是致死/适合度下降主因之一。以fabH-ycfH区段为例，恢复被损启动子后菌株恢复生长。
Genome annotation errors leading to unassigned codons（导致未分配密码子的基因组注释错误）
重新注释发现Ec_Syn57、Syn61Δ3及另一Syn57设计中存在大量未注释蛋白编码基因及坐标偏移，引入644、186及539个本应被消除的"禁忌/未分配密码子(Forbidden/Unassigned Codons)"。Ribo-seq显示在Syn61Δ3中核糖体在未被重编码的TCA/TCG serine密码子处显著停滞（A位峰），估计占用2.1%总翻译核糖体。案例：tadA起始密码子TTG因注释错误被重编码致无表达，修正后Segment可整合且倍增时间缩短9.57倍。表明注释错误是重编码基因组隐藏致死因素。
Editing-based debugging of lethal design errors（基于编辑的致死设计错误调试）
针对SynOMICS鉴定出的启动子/RBS/操纵子破坏，采取三种策略调试：①CRISPR/Cas9辅助MAGE插入强组成型启动子和优化RBS补偿表达（Segments 4, 7）；②重合成整个区段修正多位点设计（Segments 5, 22, 61, 64, 86）；③DIvERGE靶向诱变受扰启动子区结合生长筛选（Segment 0之ribF-ispH启动子、Segment 18之msbA-ycaQ启动子、Segment 56之pgk-fbaA操纵子），获得恢复启动子活性的有益突变，sfGFP报告验证表达部分恢复。
Laboratory evolution allows genome recoding in 11 sections（实验室进化允许11个区段的基因组重编码）
对含合成区段的菌株进行大种群自然突变率的ALE（无超诱变），140–450代（16–50天）内适合度快速提升。全基因组测序显示仅少数突变驻留重编码区。经过89轮SynOMICS整合、113轮基因组编辑、680天累计ALE，构建了11株部分重编码菌株，探索约6.1万亿变体空间，证明该方法可克服致死缺陷逐步组装合成染色体区域。
Debugging enables partial genome assembly but pleiotropic defects remain（调试使部分基因组组装可行但仍存多效性缺陷）
利用SynOMICS逆向操作实现染色体裂变与重组，合并供体菌株重编码区，最终获含35个合成区段（占全基因组39%）的菌株及含45.8%合成基因组的菌株。随重编码比例增加，最大光密度(OD600)下降，>2.2%合成基因组即丧失M9基本培养基生长能力。Biolog表型微阵列显示环境利用能力递减。相比超诱变调试，本策略仅引入少量脱靶突变及极少禁忌密码子回复。
Multi-omics-based discovery of recoding effects（基于多组学发现重编码效应）
RNA-seq与Ribo-seq比对显示部分重编码菌株及Syn61Δ3存在上千个差异表达/翻译基因。Cappable-seq发现同义重编码大幅诱导基因内隐秘启动子(Intragenic Cryptic Promoters)——包括正义与反义转录：57密码子菌株基因内反义转录起始位点(Transcription Start Site, TSS)总转录输出较亲本增加4.01倍，部分反义启动子活性匹敌正义转录。反义转录可能通过形成dsRNA降解mRNA或遮蔽RBS抑制翻译。验证显示AGC→TCT（Ser93 hypF）替换诱发最强反义启动子活性。部分ALE进化株出现rnase III (rnc)突变，暗示反义转录参与适合度缺陷。
Multi-omics-guided evolution fully restores fitness（多组学引导进化完全恢复适合度）
基于Ribo-seq鉴定下调/上调基因，设计114条寡核苷酸库恢复翻译平衡（插入组成型启动子库上调低表达操纵子，RBS库微调过表达基因）。四轮十次编辑结合生长筛选，使含Segments 30–35的重编码菌株倍增时间与亲本持平。对含39%合成基因组的最重构株行19轮Ribo-seq引导编辑，倍增时间由110.6±5.83 min缩至64.8±3.09 min，最大OD600由0.31升至1.01，允许再转入Segments 30–35获含45.8%合成基因组的菌株。该法较单纯ALE提速30倍以上。
讨论与结论总结
研究人员证明多组学引导的基因组合成与定向进化能实现高度有害密码子集下的基因组重编码，并揭示同义密码子替换通过破坏基因内启动子/调控基序、诱导反义转录、改变翻译起始及因注释错误遗留未分配密码子，造成转录组与翻译组全局扰动。主要结论如下：(1)注释错误与隐蔽翻译序列在重编码基因组中引入未分配密码子致核糖体停滞，合成前须用蛋白质组学与Ribo-seq确认翻译序列；(2)同义重编码可破坏内部启动子并诱发额外（尤其反义）转录起始，57密码子设计中每基因平均新增~1个启动子，全局反义转录增715%、61密码子增301%；(3)大片段（兆碱基级）重编码可暴露累积缺陷与注释错误影响，为设计提供反馈；(4)Ribo-seq指导的多重基因组编辑联合大种群ALE可高效调试巨量合成染色体区适合度缺陷且减少脱靶；(5)应避免使用含活跃移动遗传元件/原噬菌体克隆宿主。本研究提供的SynOMICS流程与多组学数据集将推动激进遗传密码重编码合成基因组的构建与应用。
