以芒草（Miscanthus × giganteus）为原料生产生物乙醇：不同预处理技术的比较研究

《Polymers》：Bioethanol from Miscanthus × giganteus: A Comparative Study of Different Pretreatment Technologies

　　

第二代生物乙醇技术基于可再生原料，具有无限的补充潜力。然而，第二代生物乙醇的生产成本仍高于第一代。生物质预处理是关键挑战，解决该问题将提高技术效率。在本研究中，研究人员对来自俄罗斯育种资源的芒草（Miscanthus × giganteus）进行了常压下稀HNO₃预处理。预处理以单阶段（HNO₃）或两阶段（（i）HNO₃后接NaOH，以及（ii）NaOH后接HNO₃）形式进行。经典的NaOH脱木质素处理也作为对照进行。随后在相同条件下进行延迟接种的同步糖化发酵（delayed Simultaneous Saccharification and Fermentation, dSSF），以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Y-3136作为微生物生产菌株。研究发现，两阶段预处理在纯度、纸浆组成、纸浆转化率、发酵过程中的生物乙醇产量以及粗生物乙醇纯度方面均优于单阶段处理（与NaOH脱木质素相比，杂质降低21倍）。然而，发酵指标并非生物乙醇生产技术的唯一关键方面。研究人员还评估了从芒草原料到目标生物乙醇产品的完整周期。在测试条件下，单阶段HNO₃预处理表现最佳。HNO₃预处理实现了50%的纸浆产率，最大生物乙醇产量为267 L/t，比NaOH脱木质素高44%。此外，HNO₃预处理可节省资源和电力，并实现原料木质纤维素基质中所有聚合物的充分商业化利用。

## 研究背景与问题提出

随着化石燃料储备日益枯竭，全球经济多个部门向生物燃料转型已不可避免。生物乙醇因燃烧与生物质形成过程中碳当量交换而被视为碳中和产品。据预测，乙醇市场将从2022年的每年1.06亿美元增长至2030年的每年1.78亿美元。第二代生物乙醇技术基于廉价的非粮纤维素原料，具有全球发展优先地位。然而，预处理技术是决定整个第二代生物乙醇技术效率的关键环节，目前预处理与酶水解成本占商业化技术总成本的40%。尽管硝酸预处理在纤维素原料方面的应用已有报道，但现有研究均在高于100°C和高于常压的条件下进行，这造成了极度危险的生产条件并阻碍其工业化 adoption。本研究的独特性在于首次在常压下使用稀硝酸溶液（4 wt%）进行预处理，此前研究团队虽将单阶段硝酸预处理应用于燕麦壳等一年生原料，但本研究首次以多年生芒草为模型纤维素原料，系统比较了不同预处理方法对完整生物乙醇转化周期的影响。

## 关键技术与方法

研究采用俄罗斯育种资源KAMIS品种的芒草作为原料，该品种为7年生植株。预处理方法包括四种：单阶段4 wt%硝酸处理8小时；单阶段4 wt%氢氧化钠处理8小时；两阶段先硝酸处理10小时再氢氧化钠处理2小时；以及两阶段先氢氧化钠处理10小时再硝酸处理2小时，均在90–96°C、液固比1:20、常压条件下进行。酶水解采用Agrocell Plus、Cellolux-A和Ultraflor Max（1:1:1）的复合酶制剂，酶用量为20 mg/g底物，46±2°C下进行72小时。dSSF过程采用初始固形物负荷60 g/L，前24小时进行酶水解，随后降温至28°C接种10 wt%酵母种子液，继续发酵72小时，总过程96小时。分析采用经典湿化学法测定组成，3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖（Reducing Sugars, RS），气相色谱法测定粗生物乙醇杂质组成。

## 研究结果

**3.1 芒草预处理及其化学组成变化**：硝酸单阶段处理使纸浆1中纤维素含量从原料的54%提升至83%，戊聚糖降低3.0倍至7.4%，木质素降低2.8倍至7.5%，总可水解物提高至90.4%。氢氧化钠单阶段处理使纤维素提升1.6倍，戊聚糖降低5.1倍，木质素降低2.3倍，但总可水解物增幅与硝酸处理相当（均提升1.2倍）。两阶段处理获得极高纯度纸浆：纸浆3和4的纤维素含量分别为96.9%和94.0%，但总可水解物仅分别为99.4%和98.3%。然而，两阶段处理的纸浆产率显著降低至32–38%，远低于单阶段处理的约50%，纤维素提取率仅为57–66%。

**3.2 酶水解反应活性测定**：未经处理的芒草72小时水解后还原糖浓度为9.8 g/L，纤维素转化率54%，底物转化率29%，表现最差。预处理后酶水解效率提升2.6–3.0倍，还原糖产率以纸浆重为基准达76–81%。活性顺序为：纸浆4 > 3 > 1 > 2 > 未处理芒草。戊糖浓度极低（占总还原糖2–7%），有利于酿酒酵母发酵。值得注意的是，最纯的纸浆3水解性反而低于纸浆4，研究人员认为这是由于纸浆3纤维素结晶度增高所致，因为高纯度纸浆的制备伴随产率下降， amorphous态纤维素发生水解。

**3.3 芒草纸浆的dSSF过程**：dSSF过程中，前24小时还原糖浓度递增，顺序为4 > 3 > 1 > 2。24小时后浓度范围为30.8–33.4 g/L。发酵结束后生物乙醇浓度排序同为4 > 3 > 1 > 2，两阶段处理的纸浆生物乙醇浓度（15.0–15.8 g/L）高于单阶段处理（13.4–14.2 g/L）。这与酵母生长状况相关：两阶段处理得到的营养基质更清洁，酵母繁殖更佳。纸浆2表现较差的原因在于还原糖浓度较低以及残留钠离子的不利影响。

**3.4 实验粗生物乙醇样品中杂质组成分析**：杂质组成强烈依赖预处理方法。纸浆1来源的粗生物乙醇主要杂质为杂醇油（791 mg/dm³异丁醇 > 285 mg/dm³异戊醇 > 156 mg/dm³正丙醇）和乙醛（510 mg/dm³），总杂质含量1.34 wt%。纸浆2来源样品杂质最高，总杂质达6.43 wt%，含大量杂醇油、8850 mg/dm³乙醛及多种酯类。两阶段预处理使杂醇油降低8–10倍，乙醛降低25–56倍，酯类降低1692–1990倍，总杂质降低18–21倍。最纯的粗生物乙醇来自纸浆3，总杂质仅0.30%。所有样品甲醇含量极低（0.001–0.007 wt%），这归因于常压预处理条件以及非粮非木材原料特性。

**3.5 芒草生物乙醇产量及与全球技术水平的比较**：以每吨芒草计，生物乙醇产量排序为1 > 2 > 4 > 3，首尾相差30%。单阶段硝酸预处理以267 L/t领先，比碱处理高44%。与全球数据比较，该产量是Szczerbowski等和Whittaker等报道值的2.0倍和1.8倍，尽管本研究固形物负荷仅为文献值的1.7–2.1分之一；与Cerazy-Waliszewska等相比，尽管初始底物负荷仅为十分之一，产量仍更高。该产量与Zhang等采用170–200 g/L高底物浓度所得结果相当。

**3.6 常压硝酸预处理的优势**：该技术具备商业化潜力，原因包括：已证明良好的可扩展性；废酸液可十倍循环利用而不降低底物反应活性；废液可作为植物肥料和生长刺激剂，实现木质纤维素组分的高值化利用。该方法满足高效预处理的多项关键标准：高酶水解效率、试剂与能源节省、无需解毒处理、常压操作安全性高、全组分利用及良好可扩展性。

**3.7 局限性及解决方案——未来展望**：单阶段硝酸预处理的局限性包括对木质纤维素基质形态的依赖性（对木材原料效果不如硫酸盐法和亚硫酸盐法），以及对韧皮原料效果不确定；此外，高腐蚀性需要昂贵耐腐蚀设备。未来发展方向包括：酶制剂的集成生产与高浓度C6糖转化、补料分批酶水解提高糖浓度、应用更高效的基因工程改造微生物生产菌株、以及将酒糟转化为沼气或饲料预混料。

## 结论

研究人员首次系统比较了常压下稀硝酸溶液单阶段与两阶段预处理芒草的方法，并与传统碱脱木质素进行了全面对比。完整转化周期分析明确表明，单阶段硝酸预处理优先于碱脱木质素和两阶段硝酸预处理。单阶段硝酸预处理提供了50%的高纸浆产率（比其他方法高1.1–1.6倍）、81%的高纸浆转化率、粗生物乙醇杂质降低5倍，以及267 L/t的高生物乙醇产量（比其他方法高17–44%）。研究还发现，纸浆越纯，粗生物乙醇杂质越少：两阶段预处理的杂质含量仅为0.30–0.36 wt%，比碱脱木质素低18–21倍。所有粗生物乙醇样品的显著特征为甲醇含量极低（0.001–0.007 wt%），这是由于常压预处理所致。研究表明，单阶段硝酸预处理技术有望成为芒草生物乙醇生产的商业化可行方案。