虾青素（Astaxanthin）通过调控JAK2/STAT3信号通路缓解缺血再灌注损伤

《International Journal of Neuroscience》：Astaxanthin alleviates ischemia-reperfusion injury by regulating the JAK2/STAT3 signaling pathway

　　

虾青素（Astaxanthin, AST）是一种含氧非维生素A类胡萝卜素，天然存在于微藻及三文鱼、鳟鱼、虾等多种海产品中。鉴于其强大的抗氧化特性，AST作为多靶点药理制剂在多种疾病管理中的应用日益受到关注。既往研究表明，AST对氧化应激具有神经保护作用，并能缓解脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury, CIRI）相关的神经功能缺损。然而，AST是否通过JAK2/STAT3信号通路抑制CIRI诱导的神经元损伤以发挥神经保护作用尚不明确。本研究旨在探究AST对氧糖剥夺/复氧（Oxygen-Glucose Deprivation/Reoxygenation, OGD/R）诱导的PC12细胞损伤的保护作用，并重点关注JAK2/STAT3信号通路的参与情况。

研究人员采用OGD/R模型模拟体外脑缺血，并使用PC12细胞（大鼠嗜铬细胞瘤细胞）和HT22细胞（小鼠海马神经元细胞）进行实验，因这两种细胞系均广泛应用于包括脑缺血在内的神经系统疾病研究。细胞经氧糖剥夺（95% N₂和5% CO₂，37°C，2小时）后，于正常条件下复氧24小时以建立再灌注模型。随后，研究人员采用噻唑蓝（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide, MTT）法检测细胞活力，应用流式细胞术进行Annexin V-FITC/碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）双染以评估细胞凋亡，通过酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）检测8-羟基脱氧鸟苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, 8-OHdG）、4-羟基壬烯醛（4-hydroxy-2-nonenal, 4-HNE）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平以评估氧化损伤，采用2',7'-二氯荧光黄双乙酸酯（2',7'-dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA）荧光探针法检测活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平。此外，研究人员运用蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术检测促炎因子肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）、白细胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）和单核细胞趋化蛋白-1（Monocyte Chemoattractant Protein-1, MCP-1）的蛋白表达水平，以及JAK2/STAT3信号通路相关蛋白磷酸化JAK2（Phospho-JAK2, p-JAK2）、JAK2、磷酸化STAT3（Phospho-STAT3, p-STAT3）和STAT3的表达情况。为验证JAK2/STAT3通路在AST保护作用中的必要性，研究人员使用JAK2/STAT3通路激活剂香豆霉素A1（Coumermycin A1, CA1）进行干预实验。

在体内实验中，研究人员采用大脑中动脉闭塞/再灌注（Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion, MCAO/R）大鼠模型。将大鼠随机分为假手术组（Sham）、MCAO/R组、MCAO/R+AST组（腹腔注射100 mg/kg AST）和MCAO/R+AST+CA1组（腹腔注射100 μg/kg CA1），每组3只。研究人员通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride, TTC）染色评估脑梗死面积，采用改良神经功能缺损评分（Modified Neurological Severity Score, mNSS）评价运动、感觉、反射和平衡功能，并通过苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色观察海马组织病理学改变。

AST促进OGD/R模型中PC12和HT22细胞的细胞活力并抑制凋亡。研究人员首先评估了AST对正常PC12和HT22细胞的细胞毒性，结果显示AST浓度≤40 μM时对两种细胞活力均无显著影响（均为对照组的90%以上），而≥160 μM时产生轻度细胞毒性。在建立OGD/R模型后，研究人员用不同浓度AST（1.25、5、10、20 μM）处理细胞。MTT结果显示，OGD/R显著降低细胞活力，而20 μM AST显著增加细胞活力；PC12细胞的半数有效浓度（Half-Maximal Effective Concentration, EC₅₀）为13.07 μM，HT22细胞为30.65 μM。流式细胞术分析表明，OGD/R组PI阳性细胞（死亡细胞）比例显著高于对照组，而AST处理显著降低了两组细胞的死亡速率。比较剂量反应数据发现，AST（20 μM）促进增殖和抑制凋亡的作用在PC12细胞中强于HT22细胞，因此后续机制实验均选用PC12细胞。

AST减轻OGD/R后PC12细胞的氧化损伤。研究人员通过ELISA和荧光探针法检测发现，OGD/R升高了氧化损伤标志物8-OHdG、4-HNE、MDA和ROS的水平，而AST处理缓解了这些效应，证实AST能够减轻OGD/R后PC12细胞的氧化损伤。

AST抑制OGD/R诱导的PC12细胞炎症反应。研究人员通过蛋白质免疫印迹检测发现，OGD/R显著增加促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1的蛋白水平，而AST处理显著降低这些因子的表达，其中20 μmol/L浓度效果最显著。

JAK2/STAT3信号通路参与AST对PC12细胞的保护作用。蛋白质免疫印迹结果显示，与对照组相比，OGD/R显著升高p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值，而AST（20 μmol/L）处理逆转了这些效应。进一步使用通路激活剂CA1后发现，CA1联合处理显著升高了p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3比值，表明AST抑制JAK2/STAT3通路的激活。

AST通过激活JAK2/STAT3信号通路保护PC12细胞免受OGD/R诱导的损伤。为确定AST的保护作用是否依赖于JAK2/STAT3通路，研究人员评估了AST和CA1共同处理后的细胞活力和凋亡情况。数据显示，CA1抑制JAK2/STAT3通路显著废除了AST的保护效应，表现为AST介导的细胞活力增强和凋亡抑制被逆转。

AST通过激活JAK2/STAT3信号通路抑制OGD/R引起的PC12细胞氧化损伤。研究人员进一步检测发现，使用CA1激活JAK2/STAT3通路后，AST对氧化损伤指标8-OHdG、4-HNE、MDA和ROS的抑制作用被逆转，提示AST通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻OGD/R诱导的氧化损伤。

AST通过JAK2/STAT3信号通路激活减少OGD/R导致的PC12细胞炎症。蛋白质免疫印迹结果显示，AST显著降低OGD/R诱导的TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1表达，而CA1激活该通路废除了AST对炎症反应的有益效应。

AST通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻大鼠脑缺血再灌注中的神经元损伤。体内实验表明，AST治疗显著减小了MCAO/R大鼠的脑梗死面积，改善了运动、感觉、反射和平衡功能（mNSS评分显著降低）。H&E染色显示，与假手术组相比，MCAO/R组海马神经元排列紊乱、细胞膜破裂、细胞肿胀、大量神经元丢失及核固缩；AST治疗显著改善了这些病理改变。此外，AST降低了炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1水平，以及8-OHdG、4-HNE、ROS和MDA的蓄积，从而缓解缺血再灌注诱导的氧化损伤。这些保护作用可能与AST下调JAK2/STAT3信号通路有关，而该通路的激活则逆转了AST对脑缺血再灌注损伤的神经保护效果。

研究结论部分指出，JAK2/STAT3探索和总结了他丁类药物的研究，为未来开发抗糖尿病药物奠定了基础。CIRI是缺血性卒中发病的关键因素。其重要机制之一是ROS水平显著升高，通过脂质过氧化和DNA损伤引发神经元损伤。此外，神经元凋亡被认为是缺血再灌注后导致神经功能障碍的关键病理事件。减轻过度ROS产生和抑制神经元凋亡可改善缺血再灌注损伤后的神经功能恢复。本研究中，研究人员同时采用PC12和HT22细胞建立OGD/R模型以模拟体外脑缺血，旨在评估AST对抗OGD/R诱导细胞损伤的效果。选择这两种细胞系是因为它们分别代表不同物种和神经元起源的模型背景，以比较AST的生物学效应并评估其广谱疗效。结果发现AST处理增强了OGD/R条件下两种细胞的细胞活力并抑制凋亡，调控趋势相似，表明核心表型在这些模型中具有可比性。剂量反应数据比较显示，AST（20 μmol/L）在PC12细胞中促进增殖和抑制凋亡的作用强于HT22细胞，因此选择PC12细胞进行后续分子机制研究。HT22细胞中的氧化损伤、炎症反应和JAK2/STAT3信号通路在本研究中未予检测，可能在未来的研究中加以探讨。

AST是一种具有强效抗氧化和抗炎特性的类胡萝卜素，被认为是能够减少缺血再灌注诱导脑损伤的潜在神经保护剂。既往报道证实AST对缺血再灌注损伤有效，多种模型确认其口服或静脉给药后的保护作用。值得注意的是，AST预处理以剂量依赖性方式抑制急性脑梗死后氧化应激从而减少神经损伤。氧化应激、细胞凋亡和神经炎症是脑缺血再灌注损伤发病的主要贡献因素。作为红色叶黄素类胡萝卜素，AST在细胞水平发挥抗氧化和抗炎效应。除对心血管健康和疾病的益处外，AST还被证明可改善脂多糖诱导的亚 fertility。因此，确立AST在人类保健中的应用具有重要意义。

大量证据表明脑缺血再灌注损伤与神经元凋亡密切相关。凋亡不仅是凋亡相关基因表达的结果，还受多种内外因素调控。脑缺血再灌注后，ROS、活性氮和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate, NADPH）氧化酶的过度产生导致严重神经元损伤并诱导凋亡。既往研究表明，AST在主动脉缺血再灌注动物模型中对氧化组织损伤和凋亡具有治疗作用。本研究中，AST促进OGD/R条件下PC12细胞的活力并抑制凋亡。ROS诱导的氧化应激已知参与脑缺血再灌注损伤的发病机制。近期研究表明，AST补充通过与二甲双胍协同作用控制氧化应激，并通过诱导核因子E2相关因子2（Nuclear Factor Erythroid-2-Related Factor 2, Nrf2）转录因子及激活超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）和过氧化氢酶增强整体抗氧化能力。

炎症反应被认为是脑缺血再灌注损伤期间关键的病理生理过程。AST抗炎效应的多种机制已被证实。IL-6是炎症反应的关键组分，MCP-1是巨噬细胞募集的重要趋化因子。研究发现AST在多种疾病中抑制MCP-1、核因子-κB（Nuclear Factor-Kappa B, NF-κB）和IL-6表达。本研究中，OGD/R暴露显著增加PC12细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1等促炎因子水平，而AST处理显著降低这些因子水平，其中20 μmol/L浓度效果最显著。

AST已被证明显著改善CIRI，但精确机制尚未完全阐明。既往研究指出，AST的抗炎作用涉及调控多种炎症介质和信号级联，包括磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（Phosphoinositol 3 Kinase/Protein Kinase B, PI3K/AKT）、NRF2、NF-κB、细胞外调节激酶1/2（Extracellular Regulated Kinase 1/2, ERK1/2）、c-Jun N-末端激酶（c-Jun N-Termerchein）。JAK/STAT通路是哺乳动物中众多细胞因子和生长因子的主要信号转导系统，在神经发生、分化和突触可塑性中发挥关键作用。STAT家族包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6七个胞质成员，参与氧化应激、凋亡、增殖、分化、信号激活和转录调控等细胞过程。具体而言，STAT1通过调控凋亡和细胞死亡相关蛋白的转录和磷酸化参与脑缺血损伤。同时，小胶质细胞和周围细胞中STAT6的激活据报道可保护缺血性脑损伤。脑缺血后，多种生长因子和细胞因子激活JAK受体，促进STAT3的酪氨酸磷酸化。磷酸化STAT3形成二聚体并转位至核内，与DNA结合调控靶基因转录。此外，STAT3激活与脑缺血后的神经炎症反应相关，并调控炎症相关基因的表达。STAT3介导的细胞因子信号在脑发育过程中支持胶质形成和神经发生，从而发挥神经保护作用。

鉴于这些观察，本研究探索了AST对STAT3信号通路的影响。研究结果表明，JAK/STAT3轴的激活废除了AST对OGD/R处理PC12细胞的保护作用。该研究为AST的潜在治疗应用奠定了重要基础，特别是其对JAK2/STAT3通路的调控效应。除AST等小分子药物外，基于肽的治疗策略是靶向JAK2/STAT3信号通路的另一有前景的方向。JAK2/STAT3信号级联涉及多种蛋白质-蛋白质相互作用，包括JAK2-STAT3结合、STAT3二聚化和核转位，这些都是基于肽药物的理想靶点。近年来，基于肽的治疗药物已成为药物研发的 promising 宝库。这些基于肽的调节剂在治疗脑缺血再灌注损伤方面显示出巨大潜力。特别是，STAT3 SH2结构域是关键蛋白质-蛋白质相互作用界面，靶向该结构域的拮抗肽已被证明可有效阻断STAT3二聚化、核转位和下游转录活性。未来研究可探索AST与这类基于肽抑制剂的联合治疗，或开发靶向JAK2/STAT3通路的肽递送系统，是否能增强脑缺血再灌注损伤的治疗效果。

研究结论：JAK2/STAT3信号通路在调控缺血再灌注损伤后细胞死亡、氧化损伤和炎症反应中发挥关键作用。OGD/R暴露导致PC12细胞中JAK2和STAT3磷酸化水平升高，伴随随后的细胞损伤。AST对OGD/R诱导的损伤发挥保护作用，至少部分通过抑制JAK2/STAT3轴实现。因此，靶向该通路以减轻神经元损伤可能是管理缺血再灌注损伤的有前景的治疗策略。