体外检测具有生物活性的金黄色葡萄球菌肠毒素B型和C1型作为体内试验的替代方法

《Microorganisms》：In Vitro Detection of Biologically Active Staphylococcal Enterotoxins Type B and C1 as an Alternative to In Vivo Testing

　　

摘要：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种主要细菌病原体，可通过产生25种外毒素（exotoxin）引起临床感染和食源性疾病。食物中毒暴发中最常涉及的毒素为金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）A～E型（SEA～SEE），系最早被发现的一类肠毒素。现有体外检测方法虽可鉴定肠毒素的存在，但无法区分毒素的生物活性形式与非活性形式；而生物活性肠毒素的检测目前仍依赖使用猫或猴催吐反应的体内试验。本研究建立了一种体外检测方法来检测具有生物活性的SEB——一种潜在的生物战剂及导致食物中毒的主要病因，以及SEC1——引起葡萄球菌食物中毒的常见毒素。该新型检测法采用基因工程改造、表达T细胞受体（T cell receptor，TCR）Vβ3亚基的Jurkat T细胞系，暴露于活性毒素后产生白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）的量呈剂量依赖性。研究人员还发现，在100 ng/mL浓度下，SEB的生物活性在70 ℃以上温度处理时显著下降，而63 ℃巴氏杀菌仅轻微降低其生物活性。本研究为判定活性毒素的存在提供了动物实验替代方法，并为毒素可能的灭活方式提供了依据。

论文解读：体外检测具有生物活性的金黄色葡萄球菌肠毒素B型和C1型作为体内试验的替代方法

《Microorganisms》刊载的该研究针对现行金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxins，SEs）检测手段无法区分有无生物活性、而确认生物活性仍需依靠猫或猴体内催吐实验这一伦理争议大且灵敏度低的问题，开发了基于超抗原（superantigen）识别机制的体外细胞学检测体系。研究人员以基因工程改造表达特异性T细胞受体（T cell receptor，TCR）Vβ3的Jurkat T细胞系联合Raji B细胞（作为抗原提呈细胞，antigen?presenting cells，APCs）为模型，通过检测SEB与SEC1诱导的白细胞介素?2（interleukin?2，IL?2）分泌量反映毒素生物活性，并验证该方法可替代动物实验，同时用于评估热处理对SEB活性的影响。

主要关键技术方法

研究人员使用基因工程Jurkat T细胞系（稳定表达TCR Vβ3，内源性TCR Vβ8被替换）与Burkitt淋巴瘤Raji B细胞系（ATCC CCL?86）作为APC共同培养；以小鼠原代脾细胞（splenocytes，取自9月龄雌性C57BL/6小鼠）做对比。通过流式细胞术（flow cytometry）验证TCR Vβ3表面表达水平；以BrdU掺入法测定脾细胞增殖；以夹心酶联免疫吸附试验（sandwich Enzyme?Linked Immunosorbent Assay，ELISA）定量上清中IL?2；以热处理后加样检测IL?2分泌变化评估SEB热失活效果；以流式细胞术检测短时共孵育后TCR Vβ3内化（internalization）/表面丢失情况。

3. Results（结果）

3.1. Confirmation That the Modified T?Cell Line Used in This Study Expresses the Human TCR Vβ3

研究人员以藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记抗人TCR Vβ3单克隆抗体染色工程Jurkat细胞，经流式细胞术分析证实该细胞系高水平表达TCR Vβ3，可用于后续超抗原识别实验。

3.2. Ex Vivo and In Vitro Cell?Based Assay for Detection of Biologically Active SEB

研究人员以不同浓度SEB分别刺激小鼠脾细胞与工程Jurkat T细胞＋Raji B细胞共培养体系，BrdU掺入法测得脾细胞增殖法检测下限约200 ng/mL SEB，而工程T?细胞/B?细胞共培养体系通过IL?2 ELISA检测SEB的下限可达10 ng/mL，且IL?2分泌量与SEB浓度呈剂量依赖性，表明该体外体系可定量具生物活性的SEB，灵敏度高于脾细胞法。

3.3. Thermal Treatment Reduces the Biological Activity of SEB

研究人员将含不同浓度SEB的磷酸盐缓冲液（phosphate?buffered saline，PBS）分别经63 ℃、70 ℃、80 ℃加热30 min后加入检测体系。结果显示100 ng/mL SEB在70 ℃和80 ℃处理后诱导IL?2分泌能力显著（p < 0.05）下降，温度越高失活越明显；该热灭活效应在较低初始毒素浓度下更为显著，归因于高温使SEB三维结构变性、削弱其与TCR Vβ3结合能力。63 ℃巴氏消毒仅轻微降低生物活性。

3.4. Detection of Active SEC1 Using IL?2 Secretion by the T?Cell Line Expressing TCR Vβ3

研究人员以梯度浓度SEC1刺激工程Jurkat T细胞＋Raji B细胞体系，通过夹心ELISA检测IL?2。SEC1同样诱导剂量依赖性IL?2分泌，检测下限达10 pg/mL，较猴体内催吐半数有效剂量（约3 μg）灵敏约3×10⁶倍，证实该体外体系可检测第二组（Group II）抗原SEC1的生物活性。

3.5. SEB at Concentrations of 10 μg/mL and 1 μg/mL Induces a Dose?Dependent and Rapid Internalization of TCR Vβ3, While SEC1 Has No Such Effect

研究人员将工程Jurkat T细胞与Raji B细胞共孵育SEB或SEC1 2 h后检测表面TCR Vβ3平均荧光强度。结果表明高浓度SEB（10 μg/mL和1 μg/mL）可剂量依赖性引起TCR Vβ3内化致表面信号降低，而SEC1无此现象，提示强效TCR Vβ3内化并非IL?2分泌触发所必需的先决步骤。

4. Discussion（讨论与结论翻译总结）

现行SEs检测多用液相色谱?串联质谱（LC?MS/MS）或免疫学方法，但均不能区分失活与具生物活性的毒素；传统动物催吐模型存在伦理问题、成本高且灵敏度有限。本研究证明，表达TCR Vβ3的基因工程Jurkat T细胞联合Raji B细胞可通过超抗原诱导IL?2分泌定量检测第二组SE成员SEB和SEC1的生物活性，检测灵敏度远高于猴体内实验，且能反映热处理导致的活性丧失程度。SEB和SEC1在食物中毒暴发及生物恐怖制剂中具有重要性，该体外替代方法有望用于食品工业中毒素灭活工艺有效性验证及食品安全监测。研究人员还观察到SEB可快速诱导TCR Vβ3内化而SEC1不能，提示不同超抗原与TCR互作模式存在差异，但TCR内化不是细胞因子分泌的必要条件。综上，该TCR Vβ3工程T细胞?Raji B细胞共培养体系可有效替代动物实验用于检测具生物活性的SEB与SEC1，是食品安全保障中的重要工具。