来源于牛不同部位微生物样品的噬菌体筛选与分离方法优化

《Microorganisms》：Optimizing Bacteriophage Screening and Isolation Methods for Microbial Samples Derived from Different Body Sites of Cattle

　　

摘要：噬菌体（Bacteriophage，简称phage）作为研究和调控牛源微生物群落的工具有望获得日益广泛的应用，但由于其宿主特异性强、不同微生物生态系统存在差异且缺乏优化的筛选方案，噬菌体的分离仍具挑战性。本研究旨在（i）优化从牛不同部位采集的微生物样品中筛选噬菌体的方法，（ii）分离靶向关键牛病原及共生菌的裂解性噬菌体，以及（iii）对所分离噬菌体及其细菌宿主进行表征。研究人员共采用13种噬菌体检测方法（含一种高通量法）对来自牛不同身体部位（n=1194）及环境来源（n=20）共计1214份样品进行筛查，最终分离得到83株噬菌体，主要来源于瘤胃液（ruminal fluid，59株）、粪便（15株）、阴道拭子（vaginal swab，7株）、鼻咽拭子（deep nasopharyngeal swab，1株）及胎儿瘤胃液（fetal ruminal fluid，1株）。这些噬菌体能抑制分属29个属的细菌，最常见宿主为芽孢杆菌属（Bacillus，34株）、大肠埃希菌/志贺菌属（Escherichia/Shigella，8株）、Shouchella属（5株）、棒状杆菌属（Coryynebacterium，4株）及赖氨酸芽胞杆菌属（Lysinibacillus，4株）。未检出能侵染化脓隐秘杆菌（Trueperella pyogenes）、溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）或牛莫拉菌（Moraxella bovis）的噬菌体。方法12（Method 12）的噬菌体回收率最高，尤其适用于瘤胃样品。本研究成功从牛胃肠道、生殖道、呼吸道及胎儿样品中回收噬菌体，证明所优化的筛选方法可用于从不同牛相关微生物生态系统中分离噬菌体，后续需进一步完善方法以提高靶向牛病原噬菌体的回收率。

论文解读：来源于牛不同部位微生物样品的噬菌体筛选与分离方法优化

《Microorganisms》刊载的此项研究针对牛源噬菌体（Bacteriophage）分离受宿主特异性、样品类型差异及传统方法局限影响导致成功率低的问题展开。牛生产中牛呼吸道疾病（Bovine Respiratory Disease, BRD）、乳腺炎及肝脓肿等由多重耐药菌引发的疾病威胁日益严重，噬菌体疗法被视为抗生素替代的重要方向，且噬菌体可精准调控瘤胃等微生物组以改善生产性能。然而经典双层琼脂法（double-layer agar assay）从瘤胃等复杂样品中噬菌体分离率极低，且针对不同解剖部位（胃肠道、生殖道、呼吸道、胎儿来源）样品尚无统一高效的筛选流程，也鲜有研究系统比较多种改良方法的效果。为此，研究人员系统采集牛多部位微生物样品，迭代优化13种噬菌体筛查方法，并以共生菌替代初始失败的病原靶标开展富集与噬斑试验，最终确立最优方法并分离鉴定噬菌体及其宿主。

为开展本研究，研究人员利用了北达科他州立大学（North Dakota State University, NDSU）7个肉牛试验（Trial #1–#7，含饲粮干预、微生物组表征及胎儿发育编程研究，经NDSU IACUC批准）共1214份样品——包括瘤胃液（Ruminal Fluid, RF，n=799）、粪便（feces，n=30）、深部鼻咽拭子（Deep Nasopharyngeal Swab, DNS，n=130）、阴道拭子（Vaginal Swab, VS，n=124）、子宫拭子（Uterine Swab, US，n=15）、眼拭子（Ocular Swab, OS，n=34）、肝活检（n=10）、肝脓肿（n=3）、乳汁（n=2）、土壤（n=12）、径流/饮用水（n=4）及市政废水（n=4），其中胎儿样品取自约180日龄胎牛瘤胃液与胎粪（meconium）。关键技术方法如下：（1）样品预处理：瘤胃液经纱布初滤、分级离心（3900×g 15 min，20,000×g 15 min）及0.22 μm滤膜过滤；拭子样品于DPBS中涡旋洗脱后同样过滤；大体积样品辅以聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）6000+NaCl沉淀浓缩噬菌体颗粒；（2）宿主菌制备：除靶向BRD等相关病原（Mannheimia haemolytica、Pasteurella multocida、Histophilus somni、Trueperella pyogenes、Moraxella bovis/bovoculi、Escherichia coli、Salmonella Typhimurium）外，从同源样品中分离好氧培养的共生菌，经16S rRNA基因Sanger测序鉴定分类；（3）噬菌体初筛采用双层软琼脂点样试验（spot assay on double-layer agar），阳性孔挑取溶菌区制备噬菌体母液并滴定噬斑形成单位（Plaque-Forming Unit, PFU/mL）；（4）方法优化过程：Methods 1–8仅以病原为宿主行离心/过滤/点样/PEG浓缩，无阳性结果；Method 9起改用同源样品分离的共生菌作宿主首次获阳性；Method 10加入单步富集（enrichment）；Method 11用多菌株细菌鸡尾酒（cocktail）富集；Method 12采用四轮连续系列富集（serial enrichments），首轮曾短暂加氯仿（后去除），样品原液不经预过滤直接加入首轮BHI肉汤并补加CaCl₂（2.5 mM）与MgSO₄（2.5 mM）；（5）另设基于96孔板的高通量筛选法（high-throughput assay）参照Olsen等人方案；（6）选取代表性噬菌体行透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察形态，提取噬菌体DNA行全基因组测序（Whole-Genome Sequencing, WGS）及注释，细菌宿主亦行WGS与GTDB-Tk分类。

3.1. Overview of the Samples Screened for Phage and Their Origin（噬菌体筛查样品来源概述）

研究人员对1214份牛源（n=1194）及环境（n=20）样品进行筛查，涵盖瘤胃、粪便、鼻咽、阴道、子宫、眼部、肝脏、胎牛及环境水/土等，为后续方法比较提供基础样本矩阵。

3.2. Evolution and Assessment of the Phage-Screening Methods（噬菌体筛选方法的演进与评估）

早期Methods 1–8以病原为宿主未检出噬菌体；Method 9改用同源共生菌为宿主首次成功分离出瘤胃源大肠杆菌噬菌体；Method 10引入单步富集后分离8株；Method 11用细菌鸡尾酒富集扩大宿主接触面。最终Method 12采用四轮系列富集，从瘤胃液（45株）、粪便（16株）、阴道拭子（5株）、DNS（1株）及胎儿瘤胃液（1株）中共分离67株（占总数81%），确认系列富集较单次富集显著提高噬菌体检出率。去除首轮氯仿步骤后额外从瘤胃液及胎儿瘤胃液再获3株噬菌体，确认氯仿可能损伤部分噬菌体。所有方法中均未从任何样品中分离出靶向所列牛病原的噬菌体。

3.3. High-Throughput Screening Method（高通量筛选方法）

对109份样品（RF、NS、TR、VS、OS）采用96孔板富集结合多点接种（multi-needle applicator）软琼脂覆层检测，靶菌为M. haemolytica、P. multocida及M. bovis，未观察到对病原的裂解，证实该方法适用于大规模初筛但对难分离病原噬菌体仍具局限。

3.4. Isolated Phages and Their Respective Bacterial Hosts（分离所得噬菌体及其细菌宿主）

全研究共分离83株噬菌体（总样品阳性率6.8%），其中瘤胃59株（同类型样品阳性率7.4%）、粪便15株（50%）、阴道7株（5.6%）、DNS 1株（0.8%）、胎儿瘤胃1株（5%）。宿主涉及29个属，以Bacillus（34株，41%）最多，次为Escherichia/Shigella（8株）、Shouchella（5株）、Corynebacterium与Lysinibacillus（各4株）。无靶向T. pyogenes、M. haemolytica、P. multocida或M. bovis之噬菌体。

3.5. Taxonomic Characterization of Bacterial Hosts and Whole-Genome Sequencing of Phages and Their Respective Bacterial Hosts（细菌宿主分类学特征及噬菌体与宿主全基因组测序）

选取11株代表性噬菌体（10株瘤胃源、1株阴道源，宿主为Alkalihalobacillus clausii 1株、Bacillus safensis 4株、E. coli 6株）行WGS，基因组大小20,216–168,609 bp，GC含量33.94%–44.35%，不含CRISPR、tmRNA、毒力因子或抗菌耐药（Antimicrobial Resistance, AMR）基因。均为有尾噬菌体（Caudoviricetes），分属Felixounavirus（2株）、Tequatrovirus（2株）、Vequintavirus（1株）、Salasmaviridae（1株）、Herelleviridae（1株）、Siophivirus（1株）及未定亚科Caudoviricetes（3株）。

3.6. Morphological Characterization（形态学表征）

TEM观察11株代表性噬菌体，均具二十面体头部及尾部，部分显示肌尾病毒科（Myoviridae）典型可收缩尾鞘，颗粒总长~180–260 nm，头径~40–100 nm，尾长~100–210 nm，证实牛源分离噬菌体形态多样性。

讨论与结论总结（Discussion and Conclusions）

研究人员经方法迭代发现：仅当以样品同源分离的好氧共生菌为宿主并引入系列富集后方能有效从牛复杂微生物生态系统中分离噬菌体；Method 12（四轮系列富集、不加氯仿、补加二价阳离子、同源共生菌为宿主）为当前最优方案，瘤胃与粪便噬菌体回收率较高，生殖道与呼吸道拭子因取样体积小致回收率低但经系列富集仍可检出；本研究首次报道从健康胎牛瘤胃液中分离出有感染活性的噬菌体，为"子宫内无菌理论"受到挑战增添证据。未能分离到靶向BRD等相关病原的噬菌体可能源于病原株实验室传代致噬菌敏感性改变、健康动物病原载量低、拭子采样量不足、噬菌体—宿主互作条件未最适（如二价离子浓度、温度、软琼脂浓度）及部分病原可能存在抗噬菌体防御系统等原因，建议未来用同群新鲜分离病原株、明确对数生长期并扩大血清型/生物型范围。本研究表明优化后的Method 12可为牛多部位微生物样品噬菌体筛查提供标准化框架，未来应进一步拓展靶宿主范围并深入解析噬菌体—宿主互作，以期应用于瘤胃微生物组调控及牛病原噬菌体疗法开发。

结论（Conclusions）

本研究通过对来源于牛胃肠道、生殖道、呼吸道、眼部及胎儿环境等多部位微生物生态系统的噬菌体筛选与分离方法进行优化——特别是建立了采用四轮系列富集、以同源共生菌为靶标的Method 12——成功从瘤胃液、粪便、阴道、鼻咽、子宫及胎儿瘤胃液中分离出裂解性噬菌体，其宿主涵盖26个细菌属。尽管未能分离出靶向关键牛病原（Trueperella pyogenes、Mannheimia haemolytica、Pasteurella multocida及Moraxella bovis）的噬菌体，本工作提供了适用于多类牛相关微生物生态系统噬菌体分离与初步表征的方法学框架，后续研究应聚焦于进一步优化分离策略、扩展宿主范围筛查及详细解析牛关联微生物群落中的噬菌体—宿主相互作用。