《Insects》：Time-Resolved Whole-Transcriptome Analysis Suggests Candidate Non-Coding RNA Regulatory Networks Associated with PBAN-Induced Pheromone Biosynthesis in Ostrinia furnacalis
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鳞翅目昆虫信息素腺中的性信息素生物合成受信息素生物合成激活神经肽（PBAN）信号通路的严格调控；然而，非编码RNA介导的转录后调控所作出的贡献仍在很大程度上不清楚。本研究旨在表征亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）经PBAN处理后转录重塑的时间
鳞翅目昆虫信息素腺中的性信息素生物合成受信息素生物合成激活神经肽（PBAN）信号通路的严格调控；然而，非编码RNA介导的转录后调控所作出的贡献仍在很大程度上不清楚。本研究旨在表征亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）经PBAN处理后转录重塑的时间性转录组变化、候选非编码RNA介导的调控关联以及时间性分子动力学。首先，研究人员对PBAN注射后6个时间点（0、20、40、60、90和120 min）采集的18个生物学独立样本进行了全面全转录组测序（WTS）。随后，系统鉴定并定量分析了响应PBAN刺激而动态变化的差异表达（DE）mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA表达模式。通过对这些多维组学数据进行整合分析并推断基于序列的相互作用关系，研究人员推断构建了一个动态的候选竞争性内源RNA（ceRNA）样调控网络。该候选ceRNA网络锚定了4个核心节点基因：PBAN受体（PBANR）、限速酶乙酰辅酶A羧化酶（ACC），以及末端生物合成酶去饱和酶（DES）和脂酰辅酶A还原酶（FAR）。qRT-PCR结果进一步支持了关键基因在PBAN应答过程中的时间性表达模式，提示该网络可为后续功能研究提供有价值的资源。
该论文发表于《Insects》，聚焦亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）雌蛾信息素腺在信息素生物合成激活神经肽（PBAN）刺激后的时间性转录调控机制。亚洲玉米螟是中国玉米生产上的重要鳞翅目害虫，其繁殖成功高度依赖雌虫释放的性信息素对同种雄虫的吸引。因此，阐明性信息素生物合成及其调控机制，不仅是理解昆虫化学生态与生殖生理的重要科学问题，也是开发环境友好型害虫防治策略的重要理论基础。既往研究已经较为清晰地建立了PBAN介导性信息素合成的经典框架，即PBAN与其受体PBANR结合后，通过Ca
2+作为第二信使激活下游信号，并经由钙调神经磷酸酶（CaN）和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）促进脂肪酸前体生成，随后再经去饱和酶（DES）和脂酰辅酶A还原酶（FAR）等下游酶系完成特征性性信息素组分的合成。然而，这一过程的研究长期主要集中于蛋白编码基因、信号级联与生化反应层面，对于非编码RNA（ncRNA）在PBAN诱导信息素合成中的转录后调控作用仍认识不足。特别是miRNA、长链非编码RNA（lncRNA）与环状RNA（circRNA）是否通过竞争性内源RNA（ceRNA）样机制协同调节核心生物合成基因表达，仍缺乏系统证据。与此同时，PBAN诱导并非静态事件，而是一个具有明显时序特征的动态生理过程，若仅依赖单一时间点研究，难以解析调控网络的连续变化与阶段性特征。基于此，研究人员设计了高时间分辨率的全转录组研究，以期系统揭示PBAN刺激后雌虫信息素腺中编码RNA与非编码RNA的动态重编程规律及其潜在调控网络。
在技术方法上，研究人员以实验室饲养的羽化后1 d健康雌性亚洲玉米螟为材料，先断头并避光处理24 h以去除内源PBAN干扰，随后注射10 pmol PBAN，并于0、20、40、60、90、120 min采集信息素腺；每个时间点设3个生物学重复，每个重复约合并50头个体。基于这些样本开展全转录组测序（WTS），同时获取mRNA、lncRNA、circRNA及miRNA数据；结合HISAT2、StringTie、miRDeep2、CIRI2、DCC、CIRCexplorer2等流程进行转录本鉴定与定量，采用DESeq2进行差异表达与时间响应分析，利用Mfuzz进行时间序列表达聚类，结合miRanda、RNAhybrid和TargetScan进行靶标预测，并通过GO、KEGG、系统发育分析、Cytoscape网络构建和qRT-PCR验证候选ceRNA样调控轴。
3.1. Sequencing Overview and Sample Reproducibility
研究人员对PBAN注射后6个时间点共18份独立样本进行了全转录组测序。常规链特异性RNA-seq每个样本获得7202万至9590万原始读段，质控后比对至参考基因组的唯一比对率和总比对率均保持稳定；小RNA测序获得1009万至1651万高质量读段，满足后续分析要求。进一步基于LRT筛选出显著波动的转录本开展三维主成分分析（3D PCA），结果显示mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA四个层面上，各时间点生物学重复聚类紧密，并沿PC1轴呈现清晰的时间漂移轨迹，说明PBAN刺激触发了持续的跨组学转录重编程，且实验重复性与数据可靠性较高。
3.2. Identification and Genomic Features of Non-Coding RNAs
研究人员采用严格的多步骤策略系统鉴定了miRNA、circRNA与lncRNA。miRNA分析共鉴定出237个miRNA，其中83个为已知miRNA，154个为新预测miRNA；长度主要集中于21–24 nt，以22 nt最为丰富，符合Dicer切割产物的典型特征。circRNA方面，初步鉴定出4855个circRNA，大多数来源于外显子区域；经CIRI2、DCC和CIRCexplorer2三种算法共同筛选后，保留3339个高可信度外显子型circRNA。lncRNA方面，通过CPAT、CNCI、CPC2和FEELnc四种工具交叉筛选，共获得2514个高可信度lncRNA。基因组分类显示，这些lncRNA以长链基因间非编码RNA（lincRNA）和反义lncRNA为主。与蛋白编码mRNA相比，lncRNA外显子更少、转录本更短、开放阅读框（ORF）更短；GC含量分析则显示circRNA最高，lncRNA较低且更接近内含子和基因间区，整体符合非编码转录本的一般基因组结构特征。
3.3. Time-Resolved Differential Expression Reveals a Major Transcriptional Remodeling Window After PBAN Stimulation
为确定PBAN刺激后转录变化最剧烈的时间区间，研究人员对相邻时间点进行了差异表达分析。结果显示，20–60 min是最显著的转录重塑窗口。特别是在20 min与40 min比较中，大量转录本表达下调，仅mRNA就有1915个显著下调；而在40 min与60 min比较中，则出现明显“反弹”，有2101个mRNA显著上调。类似变化也出现在ncRNA数据中，提示编码RNA和非编码RNA共同参与PBAN响应的动态转换。进一步基于LRT在整个0–120 min时间轴上识别时间响应分子，共获得6564个差异表达mRNA（DEmRNAs）、985个差异表达lncRNA（DElncRNAs）、2421个差异表达circRNA（DEcircRNAs）和95个差异表达miRNA（DEmiRNAs）。这些结果表明，PBAN刺激在多个RNA层面诱导了广泛且显著的时间依赖性表达重编程。
3.4. Temporal Clustering Reveals Coordinated mRNA and ncRNA Expression Modules
为解析不同RNA在时间维度上的表达轨迹，研究人员对时间响应RNA进行Mfuzz软聚类。DEmRNAs被分为6个簇，DElncRNAs、DEcircRNAs和DEmiRNAs分别分为4个簇。进一步通过聚类中心进行Pearson相关性分析，发现若干mRNA模块与ncRNA模块之间存在显著正相关或负相关关系。例如，mRNA Cluster 2与多个lncRNA簇高度正相关，却与miRNA Cluster 1和Cluster 3显著负相关；mRNA Cluster 3和Cluster 6则与lncRNA Cluster 3正相关，并与miRNA Cluster 4负相关。这一结果表明，在PBAN响应过程中，特定lncRNA、circRNA和miRNA模块与关键mRNA模块之间存在协同或拮抗的时间耦联关系，为后续推断ceRNA样网络提供了表达动力学基础。
3.5. Functional Enrichment of mRNA and ncRNA-Associated Modules
功能富集分析显示，不同mRNA时间簇代表了PBAN响应中的不同生物学层级。Cluster 2富集于G蛋白偶联受体（GPCR）相关通路和钙信号通路，提示其主要涉及上游信号感知与转导；Cluster 3富集于线粒体基因表达、线粒体翻译、蛋白靶向和跨膜运输等过程，提示其与能量代谢和细胞器功能调节相关；Cluster 6则显著富集于核糖体发生、核糖核蛋白复合体发生和tRNA生物发生，反映蛋白质合成能力发生变化。相应地，与这些核心mRNA簇时间相关的ncRNA模块，其预测靶基因富集于受体信号、磷酸化调控、脂质生物合成、鞘脂信号、线粒体膜组织及蛋白跨膜导入等过程。整体上，这说明PBAN处理不仅改变了经典信息素合成通路相关基因的表达，还伴随信号转导、脂质代谢、线粒体功能及蛋白运输等多维细胞程序的协同调节。
3.6. Identification and Temporal Expression Dynamics of Core Pheromone Biosynthesis Genes
为聚焦与性信息素生物合成直接相关的核心分子，研究人员系统筛选了PBANR、ACC、DES和FAR家族基因，并通过系统发育分析进一步定位功能候选。结果显示，LOC114358537与已实验鉴定的Δ14-去饱和酶聚为一支，LOC114357990归属于功能明确的FAR类群。在综合家族鉴定、系统发育关系和表达丰度后，最终确定4个核心基因：PBANR（LOC114363447）、ACC（LOC114349828）、DES（LOC114358537）和FAR（LOC114357990）。时间表达分析表明，PBANR在0–120 min内逐步升高，提示受体表达在PBAN响应期间持续增强；ACC总体较稳定，但在40 min出现短暂下降。DES和FAR则在0 min具有较高基础表达，至40 min显著降低，随后在60–120 min恢复。四基因总体转录丰度在20 min至40 min由142.1降至37.8，主要由DES和FAR转录本下降所致。这说明PBAN刺激后，上游信号感知、前体供给和下游末端生物合成步骤并非同步转录激活，而具有不同的时间调控特征。
3.7. Construction of Candidate ceRNA-like Networks and qRT-PCR Analysis of Representative Nodes
在ceRNA假说框架下，研究人员整合序列靶标预测与表达相关性，围绕PBANR、ACC、DES和FAR构建候选ceRNA样亚网络。构建规则包括：核心mRNA需与lncRNA或circRNA共享预测的miRNA应答元件（MRE），靶向核心mRNA的miRNA必须与其呈负相关表达，而共享相同miRNA的lncRNA或circRNA需与相应mRNA呈正相关。由此获得的候选网络显示，DES中心亚网络复杂度最高，提示下游末端生物合成步骤可能受到更复杂的转录后调控；FAR相关网络也连接多个ncRNA候选分子。相比之下，PBANR和ACC相关亚网络较为紧凑。进一步选取代表性mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA进行qRT-PCR验证，结果总体支持测序所得的时间表达趋势：候选mRNA、lncRNA和circRNA在20–60 min间先下降后恢复，而部分miRNA则呈相反变化，在其预测靶mRNA下降时升高。这为候选网络的时间表达合理性提供了实验证据。
讨论部分指出，本研究通过6个时间点的全转录组时间序列设计，建立了亚洲玉米螟信息素腺对PBAN刺激响应的动态分子图谱。研究显示，PBAN诱导的应答并非单向线性增强，而是在20–60 min经历显著的阶段性重塑，表现为40 min时大量转录本短暂下降、60 min后恢复。mRNA聚类结果提示PBAN响应涉及信号感知、线粒体活动、膜与蛋白运输以及翻译装置组装等多个功能层面，而与这些模块时间相关的ncRNA分支则在功能上与受体信号、脂质代谢、线粒体功能和运输等过程部分重叠。研究人员据此认为，ncRNA可能参与PBAN响应的多个细胞程序调控。进一步围绕PBANR、ACC、DES和FAR建立的ceRNA样网络表明，下游生物合成酶基因的潜在转录后调控架构更复杂。论文同时强调，这些网络本质上仍是基于共享MRE、表达方向一致性和相关性阈值所提出的候选框架，其生物学机制尚待功能实验验证，因此应视为提出假说和筛选优先研究靶标的资源，而非已被最终证实的分子海绵机制。
研究结论部分可概括翻译为：本研究对亚洲玉米螟信息素腺在PBAN刺激后的编码RNA与非编码RNA动态进行了时间分辨的全转录组刻画。结果表明，mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA均发生了广泛的时间性重编程，其中最显著的转录改变出现在刺激后20–60 min。PBANR、ACC、DES和FAR等关键信息素生物合成相关基因表现出彼此不同的时间表达轨迹，提示在信息素腺激活过程中，信号感知、前体供应和末端生物合成转化很可能以协调但顺序性的方式受到调控。通过整合表达相关性分析与预测的miRNA–mRNA相互作用，研究人员进一步界定了以这些核心生物合成基因为中心的候选ceRNA样调控网络。对代表性转录本进行的qRT-PCR检测证实了测序推断的时间表达模式。总体而言，该研究为后续解析亚洲玉米螟信息素生物合成的功能机制提供了系统的转录组资源和优先候选调控分子，也为该农业害虫更精准且环境可持续的防控策略设计提供了分子层面的参考。
