B群链球菌膜囊泡诱导新生儿脑膜促炎反应

《Infection and Immunity》：Group B streptococcal membrane vesicles induce proinflammatory responses in neonatal meninges

　　

摘要：无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，B群链球菌；Group B Streptococcus, GBS）是新生儿脑膜炎的首要致病原，可导致发病及存活者遗留持久性神经系统损害。GBS细胞膜含有三种独特糖脂（glycolipids），研究人员此前已证实其可促进菌血症生存及脑膜炎发生。GBS亦产生膜囊泡（membrane vesicles, MVs），但其脂质组成未知，糖脂是否影响MV生物发生、货物装载及功能亦不明确；此外，GBS MVs是否参与全身感染、脑膜炎及继发神经炎症目前尚无报道。本研究利用临床相关序列类型17（sequence type 17, ST-17）、III型荚膜野生型（WT）及其同工基因缺失糖脂突变株，发现MV脂质组再现亲本细菌细胞膜组成，且缺失糖脂菌株来源的MV蛋白质组发生改变。体外实验显示，WT及糖脂突变株来源MV均能使人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells, hCMECs）显著上调促炎趋化因子CXCL-1与细胞因子IL-6（白细胞介素-6；interleukin-6）。进一步证实MV表面蛋白介导细胞因子诱导，且该过程依赖Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）信号通路。采用新生小鼠感染模型发现，脑脊液中存在GBS MVs时，小鼠软脑膜及脑组织中CXCL-1、IL-6、TNFα（肿瘤坏死因子α；tumor necrosis factor α）及IL-1β（白细胞介素-1β；interleukin-1β）均显著升高。本研究揭示了细菌糖脂在MV生物发生中此前未被阐明的功能，并确定GBS MVs是对脑膜及脑内皮细胞具强效炎症活性的分子，可能显著促进脑膜炎疾病进展。

论文解读：B群链球菌膜囊泡诱导新生儿脑膜促炎反应

研究背景与目的

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，B群链球菌，Group B Streptococcus, GBS）是无症状定植于消化道及生殖道的机会性致病菌，也是新生儿早发及晚发性脑膜炎的最主要致病原，病死率可达9%，存活者常遗留神经后遗症。ST-17/III型荚膜株与新生儿脑膜炎高度相关。GBS穿越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）及软脑膜血-脑脊液屏障入侵中枢神经系统（central nervous system, CNS）依赖于多种毒力因子，研究人员此前发现GBS细胞膜特有之三种糖脂——葡萄糖基二酰甘油（glucosyl-diacylglycerol, Glc-DAG）、双葡萄糖基二酰甘油（diglucosyl-diacylglycerol, Glc₂-DAG）及赖氨酰-葡萄糖基二酰甘油（lysyl-glucosyl-diacylglycerol, Lys-Glc-DAG，由MprF合成赖氨酰磷脂酰甘油 Lysyl-phosphatidylglycerol, Lys-PG 伴随合成）——参与菌血症存活及透过脑血管内皮侵入脑实质。革兰阳性菌普遍分泌膜囊泡（membrane vesicles, MVs），即双层纳米球形结构，携带蛋白、脂质及RNA与宿主互作；GBS MVs已被报道包裹透明质酸酶HylB、β-溶血素/色素等毒力因子并可诱发羊膜炎及巨噬细胞NLRP3炎症小体活化，但GBS MVs之脂质精细组成（尤指糖脂及磷脂头基）、亲本细胞膜糖脂缺失对MV生物发生/货物的影响，以及GBS MVs对脑血管内皮细胞与脑膜之促炎作用均属未知。本文旨在利用COH1（ST-17/III型）及同工糖脂突变株（ΔiagB缺失全部三糖脂、ΔiagA缺失Glc₂-DAG、ΔmprF缺失Lys-Glc-DAG与Lys-PG），阐明GBS MV脂质组特征、糖脂对MV蛋白组/RNA组之调控，并评估GBS MVs在体外脑内皮细胞及新生小鼠体内对软脑膜与脑组织的促炎潜能及TLR2依赖性机制。该论文发表于Infection and Immunity。

主要技术方法

研究人员采用临床分离GBS ST-17/III型COH1株及其同工基因缺失突变株ΔiagB、ΔiagA、ΔmprF；通过超速离心结合ExoQuick-TC缓冲液从静止期培养上清分离纯化MVs；纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）表征MV粒径与浓度；酸性Bligh-Dyer萃取联合液相色谱-电喷雾电离串联质谱（liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry, LC-ESI/MS或LC-MS/MS）进行MV脂质组学分析；nano-LC-MS/MS联合DEP2软件分析MV及细菌细胞表面蛋白质组；RNA测序分析MV包裹编码转录本；人脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3）体外感染检测CXCL-1与IL-6之ELISA，并以蛋白酶K消化MV表面蛋白及TLR2小分子抑制剂（TLR2-in-C29）阻断验证信号通路；新生P1期C57Bl/6J小鼠经侧脑室注射（intracerebroventricular injection, ICV）MVs或空白脂质体对照，24小时后分离软脑膜与脑组织，Meso Scale Discovery multiplex电化学发光法检测炎性细胞因子/趋化因子。

研究结果

表型表征源自COH1及糖脂突变株的MV（Phenotypic characterization of MVs derived from COH1 and glycolipid mutants）

研究人员对MV-COH1进行LC-MS/MS脂质组学鉴定，确认其含磷脂酰甘油（phosphatidylglycerol, PG）、Lys-PG、心磷脂（cardiolipin, CL）及三种GBS糖脂Glc-DAG、Glc₂-DAG、Lys-Glc-DAG，证明GBS MV脂质组忠实复制细菌细胞膜脂质组成。利用ΔiagB（缺全部三糖脂及Lys-Glc-DAG）、ΔiagA（缺Glc₂-DAG）、ΔmprF（缺Lys-PG与Lys-Glc-DAG）分离各自MVs，NTA显示各株MV平均粒径约110 nm、浓度及尺寸分布与MV-COH1无显著差异，表明正常培养条件下亲本细胞膜糖脂或赖氨酰脂质缺失不影响GBS MV的生物发生与产量。

亲本细胞脂质组成影响MV蛋白质组（Parent cell lipid composition impacts MV proteome）

nano-LC-MS/MS检测到MV-ΔiagB仅含853种蛋白，明显少于MV-COH1（1326种）与MV-ΔmprF（1344种），三者共享822种核心蛋白。主成分分析与层次聚类显示MV-COH1与MV-ΔmprF蛋白谱较相似，MV-ΔiagB差异最大；MV-ΔiagB胞质蛋白占比下降而细胞膜蛋白比例上升。表面定位（膜+细胞壁）蛋白数中MV-COH1最多（461种），MV-ΔmprF为440种，MV-ΔiagB为356种；差异丰度分析示MV-ΔiagB较MV-COH1有11种表面蛋白显著上调（含DltD及保守表面相关抗原GBSCOH1_1973）、仅3种下调，MV-ΔmprF无显著改变。毒力因子HylB、C5a肽酶、cAMP因子在MV-ΔiagB中相对丰度升高。结论：GBS糖脂尤其是Glc-DAG系影响MV蛋白包装种类之关键，缺失糖脂减少总包载蛋白数但提高某些表面毒力蛋白相对丰度。

MV细胞表面蛋白质组反映GBS菌体表面蛋白质组（MV cell surface proteome reflects that of the GBS bacterial cell）

分离对数后期菌体表面蛋白进行LC-MS/MS，各株菌体表面蛋白总数相近（ΔiagB略少），差异丰度变化远小于对应MVs（ΔiagB活菌仅14种下调1种上调）。比较亲本菌与对应MV表面蛋白组发现WT与ΔmprF菌体与其MV检测蛋白数接近，而MV-ΔiagB表面蛋白数明显低于其亲本菌，再次印证糖脂缺失削弱特定表面蛋白被分选入MV。

脂质突变株来源MV具可变RNA货物（Lipid mutant-derived MVs have variable RNA cargo）

MV-COH1、MV-ΔiagB、MV-ΔmprF之RNA测序分别检出119、51、15条编码转录本，各有独特转录本组合；MV-ΔiagB变异性最大且有18条转录本较MV-COH1显著过表达。表明亲本膜脂质组成调控被包裹入MV之编码RNA种类与丰度。

MVs诱导脑内皮细胞产生细胞因子（MVs induce cytokine production in brain endothelial cells）

hCMECs经不同感染复数（multiplicity of infection, MOI）活菌或梯度浓度MV-COH1孵育5小时，CXCL-1与IL-6呈剂量依赖性显著升高。70 μg各株MVs处理亦显著诱导二者，水平低于活菌但明显高于未感染对照；各突变株MV间及与WT MV间无显著差异（仅ΔmprF活菌诱导IL-6高于WT活菌）。24小时LDH释放检测显示MVs无显著细胞毒性（~3%）。结论：GBS MVs以剂量依赖方式诱导脑内皮细胞促炎因子，此活性不因糖脂缺失所致MV蛋白组改变而减弱。

细胞因子产生由MV表面蛋白诱导并依赖TLR2信号（Cytokine production is induced by MV surface proteins and dependent on TLR2 signaling）

MVs经蛋白酶K预处理降解表面蛋白后，hCMECs中CXCL-1与IL-6回降至基线；hCMECs预孵育TLR2特异性抑制剂TLR2-in-C29后CXCL-1显著降低、IL-6亦下降。结论：GBS MVs表面蛋白是脑内皮细胞炎症主要驱动因子，CXCL-1诱导主要通过TLR2介导，提示MV脂蛋白/脂磷壁酸（lipoteichoic acid, LTA）为TLR2配体。

GBS MVs在小鼠软脑膜及脑内诱导炎症（GBS MVs induce inflammation in murine leptomeninges and brain）

P1小鼠ICV注射9 μg各株MVs或空白脂质体，24小时后取软脑膜与脑实质行multiplex检测。MV-COH1、MV-ΔiagB、MV-ΔmprF均使软脑膜及脑组织中CXCL-1、IL-6、TNFα、IL-1β较对照组显著上调，软脑膜炎症强于脑实质，各MV处理组间无显著差异。结论：GBS MVs足以在新生鼠体内引发软脑膜与脑实质先天免疫炎症信号，可能加剧脑膜炎病程中之神经炎症。

讨论与结论总结

本研究首次证明GBS MVs是脑血管内皮细胞与脑膜促炎反应之强效介质，且其货物（蛋白组与RNA组）受细菌细胞膜糖脂组成调控。GBS MV脂质组与亲本细胞膜一致；缺失糖脂不改变MV粒径与产量，但减少MV-ΔiagB包载总蛋白数（尤其表面蛋白），增加部分毒力表面蛋白相对丰度及改变RNA包裹谱。尽管MV蛋白/RNA货物因糖脂缺失改变，所有GBS MVs仍保留强效诱导hCMECs产生CXCL-1与IL-6之能力，该过程依赖MV表面蛋白及TLR2信号。体内新生小鼠ICV模型证实GBS MVs单独即可在软脑膜与脑组织中引发CXCL-1、IL-6、TNFα、IL-1β显著升高。研究表明GBS MVs可直接参与新生儿脑膜炎发病机制，通过触发脑血管内皮及脑膜先天免疫响应促进神经炎症及潜在血脑屏障功能障碍；GBS MVs亦具作为新生儿GBS定植/疾病诊断标志物及亚单位疫苗组分之潜力。未来需明确MV内精确驱动促炎响应之蛋白组分。