基于PrestoBlue?染料显色读数检测人血清中流感病毒中和抗体(neutralizing antibody, nAb)的客观微量中和试验(microneutralization, MN)方法

《Biochemistry and Biophysics Reports》：A colorimetric readout based on the PrestoBlue? dye as an objective method for measuring neutralizing antibodies against influenza virus in human serum samples

　　

流感是一种具有显著发病率和高死亡率的传染性呼吸道疾病。针对季节性及潜在大流行流感毒株诱导的免疫应答至关重要。微量中和试验(microneutralization, MN)是评估疫苗及抗体应答的重要病毒学检测手段，但由于活病毒感染所致细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)判读困难及操作人员主观性差异，同一样本检测结果常不一致；若联合酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)则过程繁琐。本研究提出一种以PrestoBlue?试剂作为CPE显色读数的微量中和试验，研究人员采用商业人血清样本对多种流感毒株进行评价，比较主观（倒置显微镜）与客观（分光光度计）两种读数方式。结果表明，该显色法较主观CPE判读法敏感性更高，且所获滴度具可比性；该方法可实现准确、可重复的读数，降低读数不确定度并加快检测流程。

基于PrestoBlue?染料的显色微量中和试验检测人血清流感病毒中和抗体(nAb)的研究解读

流感是正链分节段负链RNA病毒，属正黏病毒科(Orthomyxoviridae)，其中人流感A型和B型可致季节性流行，A型因抗原漂移(antigenic drift)与抗原转变(antigenic shift)及人畜共患潜力具大流行威胁。现行流感疫苗免疫原性评价常用血凝抑制试验(hemagglutination inhibition, HAI)与微量中和试验(microneutralization, MN)。HAI快速经济但对部分亚型敏感性低且依赖红细胞来源；传统MN基于细胞病变效应(cytopathic effect, CPE)肉眼判读，主观性强、重复性差，与ELISA联用又耗时费力。为克服CPE主观判读局限，研究人员旨在建立并验证以PrestoBlue?（含resazurin，可被活细胞线粒体还原为resorufin）为显色读数的客观MN方法，检测人血清中抗不同流感毒株的功能性中和抗体(neutralizing antibody, nAb)，并与传统CPE-MN比较。本研究发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》。

主要关键技术方法：

研究人员采用Madin-Darby犬肾细胞(MDCK)及稳定转染人α-2,6-唾液酸转移酶(SIAT1)的MDCK-SIAT1细胞系分别培养与滴定流感病毒株［A/Wisconsin/588/2019(H1N1)、A/Cambodia/e0826360/2020(H3N2)、B/Washington/02/2019(B Victoria)、B/Phuket/3073/2013(B Yamagata)及A/Texas/37/2004(H5N1)］。使用16份商业化人血清样本（经56℃ 30 min热灭活及受体破坏酶(receptor-destroying enzyme, RDE)处理），进行两折系列稀释血清与100 TCID₅₀病毒共孵育后接种MDCK单层，设平行复孔。传统CPE-MN于5–7 d倒置显微镜下判定保护≥50%细胞的最高稀释度为中和滴度；PrestoBlue?-MN于同等时间点每孔加10 μL PrestoBlue?孵育2 h，测定570 nm/600 nm吸光度(optical density, OD)，以(细胞对照平均OD－病毒对照平均OD)/2为cut?off，OD高于cut?off判为中和，取最高稀释度倒数即滴度。数据以Spearman秩相关与Deming回归分析。

研究结果：

3.1. Optimization of cell seeding and pre-incubation time（细胞接种密度与预孵育时间的优化）：

研究人员测试150,000、200,000、300,000 cells/mL三种MDCK细胞密度及24 h与48 h预孵育，对四株人流感毒进行TCID₅₀滴定。结果显示以300,000 cells/mL接种并48 h预孵育条件下，PrestoBlue?读数与CPE读数均获较优且稳定的病毒滴度，尤以B型株明显，故选定此条件用于后续MN试验。

3.2. Comparison between CPE-based and PrestoBlue?-based MN assays（CPE法与PrestoBlue?法MN试验的比较）：

对16份人血清行四株病毒MN检测，PrestoBlue?法所得几何平均滴度(geometric mean titer, GMT)普遍高于CPE法（尤其H1N1 A/Wisconsin株），但两法趋势一致。表明PrestoBlue?法敏感性更高，能客观量化50%保护终点而不过度保守。

3.3. RDE treatment of serum samples（血清样本RDE处理的影响）：

未处理血清非特异抑制物致滴度偏高，RDE处理后两法滴度均下降（A型降幅大于B型），且CPE与PrestoBlue?法结果更接近。Spearman相关分析显示两法高度相关（A/Cambodia r＝1.0000，B/Washington r＝0.9716，B/Phuket r＝0.9681，A/Wisconsin r＝0.9063），Deming回归证实无比例偏差。说明RDE预处理可减少假阳性并使两法可比性增强。

3.4. Optimization of the H3N2 influenza virus strain in MDCK-SIAT1 cell line（H3N2株在MDCK-SIAT1细胞系的优化）：

因H3N2在MDCK-SIAT1中增殖更佳，研究人员将细胞密度降至10,000–30,000 cells/mL（24 h预孵育）滴定A/Cambodia(H3N2)。PrestoBlue?与CPE法均获高于普通MDCK的log₁₀TCID₅₀/mL值，25,000 cells/mL时达最高(13.17 log₁₀TCID₅₀/mL)，验证了MDCK-SIAT1对该亚型滴定的适用性。

3.5. Enforceability of PrestoBlue? readout for avian H5N1 influenza virus（PrestoBlue?读数对禽流感H5N1毒株的适用性）：

以强致病性A/Texas/37/2004(H5N1)感染MDCK(150,000 cells/mL, 24 h预孵育)，CPE于3–5 d出现，PrestoBlue?加样后仅需40 min孵育即读出。CPE与PrestoBlue?法TCID₅₀一致(约17.25–17.41 log₁₀TCID₅₀/mL)，证明该法也适用于高致病禽流感病毒。

讨论与结论翻译总结：

本研究建立了基于PrestoBlue?染料的显色MN方法用于定量检测人血清流感nAb。优化确定MDCK细胞以300,000 cells/mL接种、48 h预孵育为最佳条件；PrestoBlue?通过活细胞线粒体活性还原resazurin显色，以数学cut?off客观判定50% CPE中和终点，比主观CPE判读更敏感且重复性佳。RDE处理人血清可降低非特异抑制、缩小两法差异。对H3N2株使用MDCK-SIAT1细胞可提高病毒滴度；对H5N1株亦证实方法可行且需缩短染料孵育时间。与传统CPE-MN相比，PrestoBlue?-MN具客观、可定量、易于自动化、减少专业人员依赖之优势，适于大规模疫苗免疫原性筛查与新发流感毒株nAb检测，局限为仅适用于产明显CPE的病毒且需活病毒生物安全等级实验室。该方法是对经典MN及HAI等的有益补充与替代。