基于定量聚合酶链式反应(qPCR)检测废水中耳念珠菌(Candida auris)分子检测方法的有效性验证

《Microbiology Spectrum》：Validation of molecular detection of Candida auris from wastewater

　　

摘要：由于耳念珠菌(Candida auris，C. auris)具有高多重耐药率及在医疗环境中传播率不断上升的特点，其在美国疾病控制与预防中心(CDC)2019年发布的《抗生素耐药威胁报告》中被列为紧急威胁。C. auris可定植于皮肤并脱落，这使其具备高传播性，并可从废水中回收。将C. auris纳入废水监测(wastewater surveillance)工作流程有助于早期发现出现C. auris的医疗设施，并有助于更好地了解医疗系统中该病原体的流行率与趋势。本研究旨在验证一种用于C. auris定植筛查的定量聚合酶链式反应(qPCR)方案，将其应用于废水中C. auris检测的废水检测流程验证。研究人员使用废水基质进行测定，该测定显示PCR扩增效率为96.8%，标准曲线斜率为?3.4，且灵敏度高，极限检出限(limit of detection, LOD)为1.8菌落形成单位/毫升(CFU/mL)。该测定亦显示出良好的重现性。上述结果表明，用于临床标本C. auris检测的qPCR测定可经改良后准确用于废水样品中该病原体的检测。

《Microbiology Spectrum》刊载的此项研究针对新兴多重耐药医院获得性真菌——耳念珠菌(Candida auris，C. auris)，因其可经皮肤定植脱落排入医疗废水，且现行患者主动筛查耗时耗力、覆盖率不足导致监测欠缺，而废水基于流行病学(wastewater-based epidemiology, WBE)可提供低成本、全覆盖的替代监测手段，但目前缺乏将临床C. auris定性qPCR(quantitative polymerase chain reaction，实时荧光定量聚合酶链式反应)方案应用于废水样本的方法学验证数据。研究人员采用加标(spiking)模拟废水样本，对原用于临床定植筛查的CDC C. auris qPCR测定(靶向核糖体DNA内转录间隔区2，internal transcribed spacer 2, ITS2基因，含λ噬菌体DNA为抑制对照)进行废水基质下的分析灵敏度(极限检出限limit of detection, LOD)、PCR扩增效率及批间/批内重现性验证，并与培养法平行比对，证实该临床qPCR方案可可靠移植至废水C. auris检测。

主要关键技术方法：研究人员采集美国犹他州4座市政污水处理厂假定C. auris阴性混合原进水(raw influent)为废水基质；选用ATCC MYA-5002(C. auris B11221株)制备菌悬液并用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)系列稀释标定初始浓度；以1:10比例将菌液加标至混合废水并做9个10倍系列稀释，各稀释度样本经0.45 μm滤膜过滤，滤膜均分两半，分别进行培养法(盐沙氏杜氏醇肉汤Salt Sabouraud Dulcitol Broth, SSDB+氟康唑+40℃孵育后CHROMagar Candida显色+基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF确认)与分子法(Qiagen PowerSoil DNA提取试剂盒+玻璃珠振荡破壁后按CDC C. auris qPCR方案行real-time PCR，λDNA为抑制内标)；连续3天重复测定LOD附近浓度、高于LOD浓度及阴性对照，计算Ct值均值、标准差(standard deviation, Std. dev.)与变异系数(coefficient of variation, CV)，并以Ct值对模板浓度对数绘制标准曲线求斜率与扩增效率(Efficiency = (10^(?1/斜率)?1)×100%)。

研究结果：

Analytical sensitivity and PCR efficiency（分析灵敏度与PCR效率）：研究人员将C. auris加标废水稀释系列(1.8×10⁵～1.8×10^?3CFU/mL)提取DNA后行三重重复qPCR，确定极限检出限(LOD)为1.8 CFU/mL，对应平均Ct值31.46±0.11，复孔Ct值差异≤1；以Ct值对log₁₀(模板浓度CFU/mL)作线性回归得标准曲线斜率?3.4，R²=0.9853，据此计算PCR扩增效率为96.8%，符合理想qPCR(90%–110%)要求，表明废水基质对该靶标扩增干扰可接受。

Analytical reproducibility（分析重现性）：研究人员选取LOD浓度(1.8 CFU/mL)、高于LOD一个稀释度(18.1 CFU/mL)及未加标阴性废水，在3个独立日各行三重重复qPCR(即inter-assay重现性)，LOD与18.1 CFU/mL处的CV分别为1.21%与1.22%，阴性对照Ct波动CV为1.64%，三日间Ct标准差<1，证明该测定在废水基质中具有高批间重现性。

讨论部分总结：研究人员指出C. auris主要经医疗环境传播且可形成生物膜并在排水系统中增殖，故废水监测宜聚焦医疗机构排污而非社区污水；本研究首次公开验证了CDC临床C. auris ITS2 qPCR方案在废水样本中的性能参数——LOD 1.8 CFU/mL、扩增效率96.8%、CV<2%、可检出所有已知进化支(clade)，与原临床验证敏感性及特异性相符；但因废水成分复杂，高悬浮物或强抑制剂存在时性能可能变化，且目前缺乏活菌WBE判读指南，后续需结合患者流行病学数据建立量化关联。结论可译为：原先仅供临床标本C. auris定植筛查使用的qPCR测定，经本研究验证可在废水基质中以高灵敏度与高重现性可靠检出C. auris，支持将其整合入现有废水监测流程，特别适用于尚无直接患者筛查条件的地区开展医疗系统C. auris流行预警。