《Biosensors and Bioelectronics》：Multiple DNA cycle amplification-assisted one-pot isothermal Cas12a for ultrasensitive nucleic acid detection
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Xiaoxi Zheng|Hang Li|Shuo Yao|Xinrui Wang|Jun Wang|Caihong Yin|Juan Wang|Chao Zhao中国吉林省长春市吉林大学公共卫生学院，严重人畜共患传染病诊治国家重点实验室，教育部人畜共患病研究重点实验室，邮编13
Xiaoxi Zheng|Hang Li|Shuo Yao|Xinrui Wang|Jun Wang|Caihong Yin|Juan Wang|Chao Zhao
中国吉林省长春市吉林大学公共卫生学院，严重人畜共患传染病诊治国家重点实验室，教育部人畜共患病研究重点实验室，邮编130021
摘要
快速且超灵敏的核酸检测对于环境监测和生物医学诊断至关重要。本文我们报道了一种模块化的单锅等温平台，该平台整合了催化发夹组装、滚环扩增以及CRISPR-Cas12a技术，构建出一种自我强化的多层DNA电路。在该系统中，Cas12a的顺式切割会产生短DNA片段，这些片段能够递归激活催化发夹组装和滚环扩增过程，从而形成自我维持的级联扩增循环；而反式切割则可实现实时荧光信号检测。利用这一单锅平台，SARS-CoV-2的S基因和N基因的检测下限分别可达62阿摩尔和58阿摩尔，根据所需灵敏度的不同，整个检测时间在20到120分钟之间。此外，通过将单链DNA探针功能化到金纳米粒子上，被切割的DNA可以恢复荧光标记物的荧光强度；而冻融作用引起的金纳米粒子聚集则会产生可见的颜色变化和可测量的光热信号，从而无需复杂仪器即可实现三种模式的信号检测。该系统在控制实验中表现出良好的区分能力，显示出其在即时检测应用中的潜力。这种集成化、单锅操作且可扩展的平台为快速、灵敏且多模式的核酸检测提供了通用策略，可应用于多种检测目标。
引言
快速且超灵敏的核酸检测对于环境监测和分子诊断而言极为重要（Ko等人，2022；Vandenberg等人，2021）。目前常用的黄金标准检测方法主要是聚合酶链反应，该方法需要精确的热循环条件以及复杂的仪器设备（Corman等人，2020）。为了解决这些局限性，各种等温扩增和信号放大技术应运而生，包括环介导等温扩增、重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、杂交链反应以及催化发夹组装等。尽管这些方法效率较高，但往往存在非特异性扩增的问题，这会在复杂样本中导致假阳性结果（Peeling等人，2021；Vandenberg等人，2021）。
由于具备可编程性和高特异性，规律间隔短回文重复序列-CRISPR相关蛋白系统在诊断领域受到了广泛关注。在V型效应蛋白中，Cas12a仅需一条CRISPR RNA即可工作，并且能以高准确性识别TTTN型原间隔序列序列元件。Cas12a既具有序列特异性的顺式切割功能，也具有非特异性的反式切割功能，这两者共同使得它能够实现精准的靶标识别和信号放大（Krysler等人，2022；Yuan等人，2024）。值得注意的是，其操作温度范围（37–42℃）与上述的重组酶聚合酶扩增、滚环扩增、杂交链反应以及催化发夹组装等技术兼容，这为开发集成化的单锅诊断平台提供了可能。在大多数传统的CRISPR诊断方法中，顺式切割主要用于靶标识别，而信号检测则依赖于上游的核酸扩增以及Cas12a的反式切割功能。然而，这类系统的信号放大能力从根本上受到上游扩增效率的限制，一旦上游扩增达到饱和状态，整体的检测灵敏度就会下降（Broughton等人，2020；Chen等人，2020）。虽然顺式切割也有助于信号生成，但在传统系统中这一功能尚未得到充分利用。另外，单模式荧光检测容易受到样本基质的影响，从而降低在复杂样本中的分析稳定性（Arshad等人，2024；Zhang等人，2024）。
为了解决传统核酸检测存在的这些问题，我们开发了一种集成有催化发夹组装、滚环扩增以及由Cas12a驱动的CRISPR功能的单锅多层DNA电路。Cas12a的顺式切割能够触发自我维持的扩增循环，而反式切割则可实现实时信号检测。同时，将FAM标记的单链DNA功能化到金纳米粒子上，就可以实现荧光、比色以及光热检测，从而减少对专用仪器的依赖。以SARS-CoV-2的S基因和N基因为模型靶标，该DNA电路平台成功检测出了废水样本中的假病毒，证明了其在环境监测和分布式诊断中的应用潜力。其模块化设计为构建针对不同核酸靶标的CRISPR耦合扩增网络提供了灵活的框架。
章节节选
CRC系统的机制研究
我们通过整合催化发夹组装、滚环扩增以及CRISPR-Cas12a技术，开发出一种单锅多层DNA电路扩增策略，进而构建出一种超灵敏的核酸检测系统。如方案1a所示，该DNA电路系统包含经过修饰、带有可分离P链片段的结构，以及一个圆形DNA模板，该模板上集成了P序列识别模块、催化发夹组装触发模块以及CRISPR-Cas12a激活模块。将靶标RNA引入到
结论
在本研究中，我们开发了一种用于超灵敏检测SARS-CoV-2 S/N基因的单锅DNA电路平台。该平台能够在20分钟内实现飞摩尔级别的检测，在120分钟内实现阿摩尔级别的检测，同时还能保持良好的区分能力。通过将催化发夹组装、滚环扩增以及CRISPR-Cas12a集成在同一个反应体系中，形成了一个具有反馈调节功能的级联扩增结构，相比单独使用催化发夹组装或滚环扩增系统，该结构的信号放大效率更高。这种组合方式
CRediT作者贡献说明
Xiaoxi Zheng：数据整理、软件使用、验证、可视化、初稿撰写。Hang Li：数据整理、指导、审稿与编辑协助。Shuo Yao：软件使用、可视化处理。Xinrui Wang：验证工作。Jun Wang：实验研究、可视化处理。Caihong Yin：软件使用。Juan Wang：资源提供、指导、审稿与编辑协助。Chao Zhao：概念设计、形式分析、资金筹集、资源协调、指导、可视化处理、审稿与编辑协助。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
作者感谢以下机构的资金支持：中国国家自然科学基金（项目编号：82373628、82473636和82504552）、科技创新团队计划（天山创新团队）（项目编号：2022TSYCTD0013）以及白求恩医学院“医学+X”跨学科创新团队计划（项目编号：2025JBGS07）。
