匍匐翦股颖草坪中褐斑病病原的实时荧光定量聚合酶链式反应检测采样方法优化

《Grass Research》：Optimizing a sampling method for quantitative polymerase chain reaction detection of dollar spot pathogens from creeping bentgrass

　　

褐斑病是由Clarireedia属物种引起的一种草坪草叶枯病（foliar blight）。既有的实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）方案已被证明能够定量无症状和有症状组织中的Clarireedia丰度，因此该方法可作为田间病原监测的有用工具。由于qPCR检测仅使用极少量组织，因此有必要从大面积草坪群落中获得准确且具有代表性的样本。本研究的主要目标是确定用于qPCR分析的最佳采样方法，以便在匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera）田间实现对Clarireedia的准确检测与定量。研究采用了2个易感匍匐翦股颖品种，即‘Crenshaw’（2020年）和‘Independence’（2021年）。每年均从12个重复、面积为0.91 m × 1.52 m、修剪高度为9.5 mm（bench set）的试验小区采集有症状和无症状样品。利用qPCR测定以下样品的平均循环阈值（cycle threshold, Ct）：（1）10个单独土芯，规格为1 cm × 2.5 cm深，作为子样本分别检测；（2）由10个1 cm × 2.5 cm深土芯构成的混合样；（3）通过两种高度的垂直切割（4.8或7.1 mm bench set）获得的组织。总体而言，垂直切割被证明是定量叶部Clarireedia的最佳采样方法。与土芯和混合样仅覆盖每个小区0.23%的面积相比，垂直切割可覆盖2.62%的小区面积；其Ct值变异性最低，能够稳定识别含有无症状和有症状组织的小区，并且该方法便于高尔夫球场草坪管理者采纳，用于监测Clarireedia种群、安排杀菌剂施用，并有望减少杀菌剂投入。

该论文发表于《Grass Research》，聚焦于草坪褐斑病病原的田间分子监测方法优化。褐斑病由Clarireedia属真菌引起，是冷季型与暖季型草坪草上最常见的病害之一，表现为叶枯型病斑，形成小型、圆形、略凹陷的病斑中心。该病在生长季内通常以若干相对稳定的初侵染位点形成流行簇，但不同年份的发生位置并不固定，且病原可在无症状与有症状草坪群落中随机分布。这种空间分布特征决定了病原监测不仅要“检得出”，更要“取样准”。既往研究已建立针对Clarireedia属的实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR，实时监测扩增信号并定量目标DNA）检测体系，能够在症状出现前从田间样品中定量病原，说明其具有用于病害预警和精准施药的潜力。然而，qPCR本身仅需极少量模板组织，这使得样品是否具有代表性成为限制其田间应用的核心问题。特别是在高尔夫球场球道这类大面积、病害管理依赖高频杀菌剂施用的场景中，如果能在症状出现前准确评估Clarireedia种群丰度，就有望更合理地安排施药时期，从而降低药剂投入。

围绕这一问题，研究人员系统比较了3类采样策略在9.5 mm修剪高度匍匐翦股颖草坪中的适用性：其一，将10个小直径土芯分别作为独立子样本检测；其二，将10个土芯混合后作为复合样检测；其三，采用垂直切割（vertical mowing/verticutting，利用多片窄刃切入草冠层采集组织）收集样品，并进一步比较4.8 mm与7.1 mm两种垂直切割深度的影响。研究选用两个对褐斑病易感程度相近的匍匐翦股颖品种‘Crenshaw’和‘Independence’，分别在2020年和2021年开展田间试验，对无症状与有症状样地进行重复采样，借助Ct值评估病原相对丰度。研究结论明确指出，在所有比较方法中，7.1 mm垂直切割最适合作为田间qPCR监测Clarireedia的采样方式，因为该方法兼具更大采样覆盖面积、更低检测变异、更稳定的阳性识别能力以及较低草坪损伤风险。这一结论对于草坪病害精准监测具有重要实践意义，为将分子检测工具真正转化为高尔夫球场病害管理决策手段提供了方法学基础。

研究采用的关键技术方法主要包括以下几类。首先，在美国新泽西州North Brunswick田间建立随机完全区组设计试验，以‘Crenshaw’8~9年生草坪和相邻‘Independence’草坪为研究材料，分别设置无症状和有症状小区，并记录病斑中心数量。其次，比较10个单独土芯、10土芯混合样以及垂直切割样品3种采样方式，其中垂直切割在2020年比较4.8 mm和7.1 mm两种高度，2021年采用7.1 mm。再次，对样品进行液氮研磨、DNA提取，并依据既有Clarireedia属特异性qPCR体系进行三重复扩增检测，以Ct值作为病原浓度指标。最后，利用Student’s t检验、方差分析（ANOVA）及Tukey事后多重比较评估不同采样方法和切割高度的差异。

在研究结果部分，论文首先设置了“Vertical mowing height comparison”这一部分。该部分通过比较2020年‘Crenshaw’材料中4.8 mm与7.1 mm两种垂直切割高度下的Ct值，评估采样深度对病原检测结果的影响。结果显示，无症状小区两种高度的平均Ct值分别为30.8和30.9，有症状小区分别为21.4和21.8。两类样地中，不同垂直切割高度对Ct值均无显著影响。这说明在所测试范围内，加深垂直切割并不会显著改变Clarireedia检测浓度，而7.1 mm因切割更浅、对草坪损伤更轻，因此在实际应用中更具可行性。

随后，在“Sampling method comparison”部分，研究人员系统比较了3种采样方法在2020年和2021年无症状与有症状小区中的表现。结果显示，无论年份还是症状状态，垂直切割样品的平均Ct值均低于单独土芯法，表明垂直切割获得的样品中病原浓度更高、检出效率更强。对于无症状样地，2020年垂直切割的Ct值低于复合样，而2021年二者差异不显著；对于有症状样地，垂直切割与复合样的Ct值相近。与此同时，复合样在有症状样地中的Ct值低于单独土芯，说明复合样常受到病原含量最高的单个土芯影响，造成结果偏倚。在变异性方面，垂直切割在整个研究期间无论无症状还是有症状样地，均表现出最小的标准差；无症状样地中复合样变异最大，而有症状样地中单独土芯法的子样本间变异最大。这些结果共同表明，垂直切割不仅更容易检测到病原，而且结果更稳定。

在ANOVA分析中，研究人员进一步从统计学角度检验了采样方法、重复以及二者互作对Ct值的影响。结果显示，除两个有症状数据集中的“采样方法×重复”互作项不显著外，其余因素均达到显著水平。这表明在无症状样地中，不同采样方法之间的差异更容易受到地块间病原随机分布的影响，而在有症状样地中，各方法之间的差异相对更一致。进一步的Tukey事后检验表明，垂直切割与单独土芯之间在所有数据集中差异均显著；复合样与单独土芯在两个有症状数据集中差异显著，但在无症状数据集中差异不显著；垂直切割与复合样多数情况下差异不显著，仅2020年无症状样地中垂直切割显著优于复合样。由此可见，单独土芯法总体表现最弱，而复合样虽在部分条件下接近垂直切割，但稳定性不足。

论文讨论部分围绕“理想采样方法”的判据展开。研究人员指出，理想方法既要从草坪群落中采得具有代表性的样品，又不能造成过度机械损伤。7.1 mm垂直切割之所以被认定为最佳方法，关键在于其在较低伤害条件下实现了较大范围取样。按小区面积计算，垂直切割覆盖面积达到2.62%，而单独土芯和复合样均仅为0.23%。更大的采样覆盖范围提高了随机分布病原被纳入样本的概率，因此尤其适用于无症状阶段的田间监测。相较之下，单独土芯和复合样虽也能在田间持续检出Clarireedia，但其Ct值变异更大，说明其对地块内病原空间异质性更敏感。在有症状草坪中，复合样偏向病原浓度最高的土芯；单独土芯法则因子样本间差异过大而降低定量准确性，平均标准差约3.65个Ct，这代表病原浓度可相差约10³倍。因此，这两种方法均不适合作为准确反映田间Clarireedia丰度的常规取样手段。

讨论还指出，虽然4.8 mm和7.1 mm两种垂直切割深度产生了几乎一致的Ct值，但即使是损伤较轻的7.1 mm垂直切割，如需在整个生长季每1~2周频繁重复实施，也可能仍然偏具破坏性。此外，尽管本研究未将常规修剪收集的草屑纳入正式比较，因为在有症状样地下凹病斑位置较低、常规修剪难以采到病部组织，但既往工作表明，常规修剪样品能够持续检出无症状草坪中的Clarireedia。因此，研究人员提出，在无症状监测场景下，常规修剪或与垂直切割交替应用，可能成为降低草坪损伤的潜在策略，但这一点仍需进一步研究验证。该表述保持了论文原文的谨慎性，并未将其作为已证实结论。

研究结论可概括为：在维持9.5 mm修剪高度的匍匐翦股颖草坪中，垂直切割采样，尤其是7.1 mm高度的垂直切割，是用于qPCR检测和定量Clarireedia的最佳田间采样方法。该方法采样面积更大、Ct值变异更低、能够稳定识别无症状和有症状样地中的病原，且对草坪造成的损伤相对较小，因此适合高尔夫球场草坪管理中对Clarireedia种群进行监测，并可为杀菌剂施用时机优化及投入降低提供技术支撑。