综述：基于计算方法的策略，用于调控工业生物催化与环境应用中的酶pH值分布

《Enzyme and Microbial Technology》：Computationally guided strategies to modulate enzyme pH profiles for industrial biocatalysis and environmental applications

　　穆尼尔·艾哈迈德|穆罕默德·瓦利德·伊克巴尔|穆罕默德·乌斯曼·米尔扎|穆罕默德·阿里·拉扎|胡达·艾哈迈德·阿尔加姆迪|赛义德·齐尚·海德尔|穆罕默德·佐海布·纳瓦兹|中国沈阳东北大学医学院与生物信息工程学院，邮编110819

摘要
酶是不可或缺的生物催化剂，但由于其作用pH范围较窄，其在工业和环境领域的应用往往受到限制。本综述全面概述了通过计算引导策略来合理设计酶的pH值曲线、改变最适pH值、扩展功能范围以及提高耐酸或耐碱性的方法。文中还探讨了用于设计pH敏感酶的机制性方法，包括静电优化（活性位点pKa调节、表面电荷工程）、稳定性增强（盐桥和氢键网络设计），以及利用恒pH分子动力学和自由能计算进行的动态分析。除了基于物理的方法外，本文还强调了数据驱动和人工智能方法的重要作用，如机器学习、进化引导的共识设计以及用于新序列探索的生成式蛋白质语言模型。通过将机制性生物物理模型与人工智能驱动的发现相结合，混合计算工作流程实现了从回顾性解释到预测性设计的范式转变。计算引导的合理酶工程设计为开发具有强大pH适应能力的生物催化剂提供了协同框架，有助于实现更可持续的工业流程和有效的环境技术。

引言
酶因其高特异性、高效性及环保特性，在食品加工、制药、纺织和生物精炼等多个工业领域中都是不可或缺的生物催化剂[1]。例如，裂解型多糖单加氧酶可提升生物质转化过程中难以分解的纤维素的糖化效率[2]。微生物肽酶在食品加工、清洁产品及制药领域至关重要，而纤维素酶则对生物燃料、纺织和食品工业中的纤维素降解起着关键作用[3]。蓬勃发展的生物催化领域为传统化学工艺提供了可持续的替代方案，推动了绿色经济的发展[4][5]。然而，天然酶的最适pH范围通常较窄，这限制了它们在那些常常需要极端pH条件的各种工业应用中的使用[6][7]。在许多工业和环境应用中，过程往往在非生理pH条件下进行，天然酶狭窄的最适pH范围给这些应用带来了巨大挑战[8]。

在造纸工业中，酶处理，尤其是木聚糖酶的应用，被用于漂白和脱墨。但制浆过程往往涉及酸性或碱性环境。例如，一些广泛使用的GH11类木聚糖酶具有特定的最适pH值，当它们需要在化学制浆的酸性环境或后续漂白阶段的碱性环境中发挥作用时，就会出现不匹配的问题。对于分解纤维素至关重要的天然纤维素酶，在纸浆加工通常呈酸性的环境中也面临挑战[9]。同样，蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等酶也被添加到洗衣剂中以分解污渍。现代洗衣剂通常在碱性环境下工作以提高清洁效果，然而许多天然酶在高pH条件下无法保持稳定或活性，从而导致性能下降。在生物修复等环境应用中，酶被用来降解污染场所的污染物，而这些场所的pH值可能差异很大，从高度酸性的矿井废水到碱性的工业废物不等。用于生物修复的酶必须能够在如此多样且往往极端的pH范围内有效发挥作用才能取得成功[10]。食品加工过程中使用的酶也有特定的pH要求，这些要求可能与天然酶的最适pH值有所不同。例如，用于奶酪成熟的蛋白酶可能需要在略带酸性的pH环境下工作，而其他酶则可能需要在中性或碱性环境中发挥作用[11]。这就需要通过对酶进行工程改造，使其能在这些特定且往往恶劣的pH条件下发挥最佳性能。

周围环境的pH值会通过改变关键氨基酸残基的质子化状态，从而影响酶的稳定性和活性，进而影响维持酶三维结构的内部静电力[12]。每种酶都有一个其活性最高的最佳pH值，一旦偏离这个值，就可能导致酶不可逆地变性。例如，在低pH值下，天冬氨酸残基的电荷从负电荷变为中性电荷，就会破坏对酶稳定性至关重要的盐桥。许多酶促反应的活性随pH值的变化呈钟形曲线，这反映出催化作用需要酸性和碱性残基都具有特定的质子化状态[13]。过去，要实现酶促反应所需的pH值，通常是通过调整整体溶液的pH值或使用缓冲体系来实现的。然而，这些方法往往无法解决酶本身对pH值的敏感性问题，尤其是在复杂的工业环境中。例如，将酶固定在聚阳离子水凝胶上，可以创建一个局部微环境，其pH值明显高于整体溶液的pH值，从而改变酶的有效最适pH值[8]。因此，需要对酶进行修饰，以提高其在不同pH值下的适应性，进而增强其稳定性和活性，提高其在工业中的实用性。

定点突变是一种精确的技术，可用于改变蛋白质中的特定氨基酸序列，从而使研究人员能够研究结构与功能之间的关系，并设计出具有更好性能的酶[14]。该方法涉及对编码酶的DNA序列进行特定修改，通常使用定制设计的错配引物和高保真PCR技术。定点突变的实用性体现在它被用于确定酶的活性位点[15]，以及提高酶的耐热性[16]或催化活性[17]。例如，在一项研究中，通过丙氨酸扫描和虚拟饱和突变技术，找到了α - L-鼠李糖苷酶的九个突变位点，由此得到了一个具有更高耐碱性和酶活性的突变体（R307Y）[18]。同样，定点饱和突变技术使二乙酰壳二糖脱乙酰酶的催化效率提高了数倍，比活性提升了70.02%[19]。已有大量案例表明，通过定点突变调节重要酶的pH值曲线，能够取得显著成果。

尽管定点突变具有实用性，但它也可能存在一定的难度。它依赖于对蛋白质结构与功能关系的深入理解，而对于复杂的酶系统来说，这种理解往往很难获得。合理设计通常会结合定点突变，与随机突变和高通量筛选相比，它更具效率且更为精准。合理设计利用计算工具和详细的结构分析来预测有利的突变，从而减少随机方法所带来的繁重实验工作量。本综述重点介绍用于设计酶的pH行为的计算引导策略，包括改变pH最适值、扩展功能pH范围以及提高酶的耐酸或耐碱能力，以适应工业和环境应用的需求。本文强调突变设计的理性逻辑，注重整合结构、静电和序列方面的信息，而非仅仅依赖实验筛选。此外，本文还阐述了新兴的人工智能和机器学习方法如何与基于物理的方法相辅相成，从而加速并优化以pH值为目标的酶工程研究。

尽管酶工程已经取得了显著进展，但专门针对酶的pH值曲线调控、基于机制的计算策略的系统性研究仍然较为有限。在此背景下，本综述独特地聚焦于酶pH行为的合理工程设计，将静电pKa调节、恒pH分子动力学以及基于稳定性的设计整合到一个统一的计算框架之中。此外，本研究还将质子化平衡与结构动力学及催化功能联系起来，提供了以往综述中未曾系统阐述的机制性视角。重要的是，我们还将新兴的人工智能和生成建模方法纳入以pH值为目标的酶设计范畴，有效地将基于物理的模拟与现代的数据驱动方法结合起来。总体而言，这种专注且综合的视角使得本综述区别于以往的研究，同时也填补了当前文献中的这一空白。为了提供超越方法论列举的概念性阐释，我们将计算pH工程围绕三个相互关联的轴来展开：（i）静电轴，它决定了质子化平衡和活性位点的反应性[20]；（ii）结构轴，它涵盖了在pH应力作用下的盐桥、氢键网络以及整体的折叠完整性[21]；（iii）动态轴，它描述了只有通过恒pH分子动力学才能观察到的与质子化相关的构象转变[22]。我们认为，目前许多pH工程研究的局限性在于，将这些轴视为独立的变量，而在实际情况下，质子化事件会在结构网络中传播，并以一种耦合的、非叠加的方式重塑构象集合。本综述始终运用这一三轴框架来定位各种方法，揭示它们在机制上的不足之处，并阐明为何未来的pH工程工作流程必须将人工智能驱动的候选基因生成与基于物理的验证相结合，而不是将这些方法视为独立或可互换的工具。

段落节选
pH值曲线调控的计算策略
酶pH值的合理工程设计依赖于一系列互补的计算策略，每种策略针对的是决定pH敏感性的不同生物物理因素。以下分类方式将这些策略从着眼于局部活性位点化学性质的策略，到增强整体稳定性的策略进行了整理，最后是利用进化信息和机器学习的数据驱动方法[23]。
pH引导设计的计算工具包
本部分介绍了实现酶的合理、pH引导式工程设计所需的基本计算基础设施。这些工具将调节质子化平衡和优化静电网络等生物物理原理转化为可行的设计策略，构成了计算引导设计的技术基础。它们共同为一个多尺度、多分辨率的分析框架提供了支持，用于分析和操控蛋白质结构与……之间的复杂相互作用。
人工智能和机器学习在pH值曲线设计中的崛起
人工智能和机器学习的整合正在将酶工程从一种基于物理、依靠假设检验的学科，转变为一种基于数据、具有预测能力的科学。这种范式转变对于pH值曲线工程尤为重要，因为在pH值曲线工程中，最优功能是由质子化状态、静电作用、构象动力学以及长距离上位效应之间的复杂相互作用所决定的。人工智能/机器学习方法擅长学习这些非线性、多尺度的……
讨论：整合、挑战与未来展望
设计出具有特定pH值的酶，体现了生物物理洞察力与计算方法学的融合。正如本综述中所展示的，pH稳定性是一个多因素属性，它源于静电作用、结构稳定性、构象动力学以及进化约束之间的复杂相互作用。计算引导设计为分析这些因素并将它们转化为可行的工程设计方案提供了一个统一的框架。
结论
本综述详细阐述了计算引导设计相较于传统的经验方法，在设计酶的pH值曲线方面所具有的显著优势。通过明确建模质子化平衡、静电场、结构稳定性以及构象动力学之间的基本联系，计算引导设计提供了对pH值影响酶功能的机制性理解。这一理解使得酶工程从一种试错过程转变为一种理性的、以假设为驱动的过程。
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CRediT作者贡献说明
穆尼尔·艾哈迈德：撰写——初稿。穆罕默德·瓦利德·伊克巴尔：撰写——初稿。穆罕默德·乌斯曼·米尔扎：撰写——审阅与编辑。穆罕默德·阿里·拉扎：撰写——初稿。胡达·艾哈迈德·阿尔加姆迪：撰写——审阅与编辑、资金获取、概念构思。赛义德·齐尚·海德尔：撰写——审阅与编辑。穆罕默德·佐海布·纳瓦兹：撰写——审阅与编辑、资金获取、概念构思。昆宇：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理。
未引用参考文献[39]。
致谢
本研究得到了中国江苏省优秀博士后人才资助计划的支持（资助编号：2022ZB652）。作者们还要感谢国王卡利德大学的研究与研究生院，该机构通过编号为RGP2/665/46的重大研究项目为本研究提供了资金支持。