《Protein Expression and Purification》：Rapid Generation of Drosophila Schneider 2 (S2) Cell Lines and FACS-Based Isolation of High-Yield Soluble or Membrane Proteins
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K?hler S|B?ning H|Immo Prinz|Krey T|Nagarathinam K|Ssebyatika G德国吕贝克大学医学结构与细胞生物学中心生物化学研究所，D-23562 吕贝克摘要高效生产毫克级、正确折叠且具有功能的真核蛋白质，依然是结构生物学和生物化学
K?hler S|B?ning H|Immo Prinz|Krey T|Nagarathinam K|Ssebyatika G
德国吕贝克大学医学结构与细胞生物学中心生物化学研究所，D-23562 吕贝克
摘要
高效生产毫克级、正确折叠且具有功能的真核蛋白质，依然是结构生物学和生物化学研究中的重大挑战，尤其是对于膜蛋白和复杂糖蛋白而言。果蝇Schneider 2（S2）表达系统为杆状病毒和哺乳动物表达平台提供了一种可扩展且成本较低的替代方案。然而，由于细胞系构建周期长以及表达水平不稳定，这一系统的广泛应用受到限制。在本研究中，我们提出了一种优化的S2表达流程，将构建稳定细胞系所需的时间从大约4周缩短至2周左右，同时不会影响蛋白质产量。为了进一步提高表达效率，尤其是针对低表达的基因载体，我们采用荧光激活细胞分选技术筛选出高表达的寡克隆细胞群。以可溶性人类白细胞抗原II类分子及跨膜蛋白hCD81作为模型蛋白，通过FACS富集技术，可溶性蛋白的产量提高了约124倍，而膜蛋白的产量则提高了约4.6倍。通过受体结合试验、SEC–MALS分析以及高分辨率晶体学方法对HLA蛋白的功能进行了验证，而对hCD81则通过配体结合试验进行检测。总体而言，这种更快速、可扩展的流程使得从小规模培养物中快速高效地生产出结构完整、功能正常的可溶性和膜蛋白成为可能，从而确立了S2细胞作为真核蛋白表达的快速可靠平台。
引言
在分子生物学、生物技术和制药研究中，生产毫克级、正确折叠且具有功能的重组蛋白仍然是一项艰巨任务。复杂折叠结构的蛋白——尤其是膜蛋白——在宿主细胞中往往会出现错误折叠或聚集等问题（Beygmoradi等人，2023年）。随着细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞以及转基因植物等蛋白表达系统的不断发展，人们已经能够更高效地生产出具有翻译后修饰的可溶性、稳定的重组蛋白（Tripathi和Shrivastava，2019年）。然而，要获得高产量的病毒蛋白、真核蛋白以及整合膜蛋白用于结构研究和功能研究仍然面临诸多困难，这进一步凸显了优化现有表达技术的必要性。
果蝇Schneider 2（S2）细胞为在真核宿主中表达可溶性和膜蛋白提供了可靠的平台。这类细胞源自果蝇黑腹种胚胎的晚期阶段（Johansen等人，1989年），可在室温下以松散贴壁或悬浮培养的形式生长，无需严格的环境控制条件。它们易于转染，而且可以通过筛选形成每个细胞含有多个整合基因拷贝的稳定细胞系（Johansen等人，1989年）。S2细胞还支持使用金属硫蛋白启动子等可控诱导系统（Johansen等人，1989年；Johansson等人，2012年），从而实现稳定且可大规模的蛋白质生产，即便目标蛋白具有毒性或结构极为复杂也是如此。值得注意的是，S2细胞可在无血清培养基中生长，其细胞密度是其他昆虫细胞系的5到10倍（相关综述见Moraes等人，2012年）。此外，在生产膜蛋白、分泌型糖蛋白或病毒抗原方面，S2细胞的产量也高于Sf9或High-Five?等传统昆虫细胞系（相关综述见Adriaan De Jongh等人，2013年；Backovic和Krey，2016年；Coker等人，2022年）。
尽管具有这些优势，传统的S2细胞操作流程仍可能导致漫长的优化周期以及较低的表达水平。Coker等人提出了Fast2Furious方案，旨在解决这些问题，该方案能够快速对S2细胞中的分泌蛋白表达进行高通量筛选。该方法将高效转染与早期表达检测相结合，能够在几天而非几周的时间内完成基因载体的评估和筛选。其优点包括适用于高通量检测、能够保留蛋白质的天然翻译后修饰，以及减少了操作时间，因此非常适合用于筛选大量基因库或测试不同的蛋白质变体。不过，Fast2Furious仅适用于瞬时表达，无法用于构建稳定且高产量的生产细胞系，而后者对于结构生物学和生物治疗领域的规模化、稳定生产而言至关重要。
在实际应用中，建立稳定的S2细胞系既缓慢又耗时，这限制了该系统在快速基因载体筛选或迭代蛋白质工程中的应用。典型的操作流程包括转染后进行多轮抗生素筛选——使用潮霉素筛选通常需要超过3周时间，而使用博莱氏菌素则需2周时间——之后才进行多克隆细胞群的扩增以及高表达细胞的筛选（Johansson等人，2012年；Iwaki等人，2003年）。由于转基因插入位点和拷贝数存在差异，稳定的S2细胞群往往表现出显著的克隆异质性，从而导致细胞群内重组蛋白的表达水平呈高斯分布（Zitzmann等人，2018年）。因此，传统上用于分离高表达细胞克隆的方法通常依赖于有限稀释克隆法或大量的克隆筛选才能找到高表达的克隆（Fuller等人，1988年）。虽然这些方法能够可靠地获得高表达克隆，但它们既费时又费力，难以大规模应用以进行快速基因载体筛选。正是这些挑战推动了诸如荧光激活细胞分选技术等新型富集方法的发展，这类技术能够直接从复杂的细胞群中快速筛选出高表达细胞。
对于那些结构极为复杂的靶标，如分泌型的多结构域糖蛋白和多跨膜蛋白，这些延迟以及有限的产量提升使得S2细胞系统相比那些虽然速度更快但可靠性稍差的表达系统（如基于杆状病毒的表达系统）而言缺乏吸引力。因此，我们需要优化相应的操作流程，既要保留S2细胞表达系统的优势，比如可扩展性、真核细胞的翻译后修饰能力以及稳定且可重复的产出结果，又要缩短从转染到首次表达所需的时间，同时保持或提高蛋白质的产量与质量。
尽管果蝇S2细胞已被用于重组蛋白的生产多年，但现有的操作流程仍需要数周时间才能建立稳定的细胞系，而且往往还需要进行大量的克隆筛选才能找到高产量的表达细胞。在此，我们提出了一种优化的果蝇S2表达流程，该流程显著缩短了构建稳定细胞系所需的时间，同时保持了蛋白质的产量和质量。我们的方法并未引入新的筛选技术，而是将FACS技术作为快速富集步骤纳入S2表达流程中，以便在混合细胞群中快速识别出高表达细胞。该流程结合了加速的抗生素筛选和简化的扩大培养步骤，必要时还可通过荧光标记和FACS技术来进一步富集高表达细胞。这种方法能够直接从多克隆培养物中快速分离出高产量的寡克隆细胞群，从而无需再采用耗时的有限稀释克隆法（Fuller等人，1988年）。以可溶性的HLA II类复合物和多跨膜蛋白hCD81作为代表性靶标，我们证明该流程能够持续生产出毫克级、结构完整且功能经过验证的蛋白质。总体而言，这些流程优化措施为生产那些难以处理的可溶性和膜蛋白，用于结构生物学和生物化学研究，建立了一个快速、可扩展且应用范围广泛的基于S2细胞的平台。
章节节选
基因载体设计
用于在果蝇Schneider 2（S2）细胞中表达的可溶性和膜蛋白的编码基因是通过gBlocks（美国Twist Bioscience公司）进行密码子优化的。为了实现可溶性HLA/IE1复合物的重组表达，我们分别将HLA-DR α链（DRA1）和β链（DRB1*03）的胞外结构域与转录因子Fos和Jun的亮氨酸拉链结构域融合在一起，同时在相应位置加入了可被烟草蚀刻病毒切割的切割位点，具体操作方式与HLA-DR2的表达方法类似（Gauthier，1998年；
快速建立稳定的S2细胞系可实现高效的大规模重组蛋白表达
果蝇Schneider 2（S2）细胞系统是用于生产重组蛋白的成熟平台，但在流程效率及蛋白质产量方面仍存在一些问题。要在S2细胞中实现重组蛋白的稳定表达，就需要将异源表达载体整合到细胞基因组中，从而形成稳定的多克隆细胞群。传统的操作流程往往涉及漫长的筛选步骤、适应无血清培养基的过程以及漫长的扩大培养阶段，最终导致
讨论
高效生产毫克级、正确折叠且具有功能的真核蛋白质，依然是结构生物学和生物化学研究中的重要瓶颈。尽管哺乳动物表达系统被广泛使用，但基于昆虫细胞的表达平台因其可扩展性、成本效益以及与多种关键翻译后修饰的兼容性而具有很大的吸引力。其中，果蝇Schneider 2（S2）细胞具有诸多实际优势，包括可通过质粒实现稳定表达
CRediT作者贡献说明
Thomas Krey教授：撰写——审阅与编辑、验证、指导、资源提供、概念构思。Kumar Nagarathinam：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化处理、验证、指导、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理、概念构思。George Ssebyatika博士：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化处理、验证、指导、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理、概念构思。
未引用参考文献
Schroedinger和Lyford，2020年。
数据与材料获取情况
相关蛋白结构已存储在蛋白质数据库中，其访问号为28ZB（即与HCMV IE1肽结合的HLA II类主要组织相容性复合物）。
资金来源
本研究由德国研究基金会（DFG，德国研究基金会）资助，项目编号为395236335。
致谢
我们要感谢Sven Geisler（吕贝克CAnaCore实验室）在FACS分选技术方面提供的专业帮助。
