毛细管电泳电容耦合非接触电导检测（CE-C4D）新方法用于定量盐酸多柔比星脂质体注射液中的离子型辅料

《ACS Omega》：A Novel Capillary Electrophoresis Capacitively Coupled Contactless Conductivity Detection (CE-C4D) Method for Quantification of Ionic Excipients in Doxorubicin HCl Liposome Injection

　　

聚乙二醇化脂质体多柔比星（DOX）因其高效的药物递送、降低的毒性和延长的循环时间而被认可。硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）在DOX的脂质体装载和保留中起着关键作用，且脂质体内(NH₄)₂SO₄浓度高于200 mM对于稳定的DOX硫酸盐纳米晶体的生成和脂质体稳定性至关重要。目前可用方法，如离子色谱（IC），用于选择性定量脂质体包裹的离子需要耗时的分离步骤。在本研究中，研究人员开发并验证了一种基于毛细管电泳的分离方法，耦合电容耦合非接触电导检测（CE-C4D），用于直接定量DOX脂质体制剂中的总（内部+外部）和外部离子型辅料。在正极性和负极性下分别进行的阳离子和阴离子分析，展示了不同的迁移顺序（阳离子：NH₄⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺；阴离子：Cl^–、SO₄^2-、F^–），并具有优异的基线分离和峰分辨率。该方法表现出线性，所有分析离子的相关系数均高于0.999，且定量限低（低于8.22 μM）。优化的CE-C4D方法能够准确量化脂质体DOX制剂中的总离子和外部离子浓度，包括NH₄⁺、K⁺、Na⁺、Cl^–和SO₄^2-离子。所有测试的脂质体DOX制剂均含有超过200 mM的脂质体内(NH₄)₂SO₄。该方法为准确量化脂质体制剂中的离子种类提供了一种替代方案，支持品牌和仿制药脂质体制剂的开发和监管评估。

论文解读：

脂质体药物递送系统已在癌症治疗等领域获得广泛应用，聚乙二醇化脂质体多柔比星（DOX）通过主动装载实现高效递送和低毒性。硫酸铵（(NH₄)₂SO₄）在DOX的装载与保留中起核心作用，脂质体内(NH₄)₂SO₄浓度需超过200 mM以形成稳定的DOX硫酸盐纳米晶体并维持制剂稳定性。目前，离子色谱（IC）是常用的定量方法，但需通过过滤将外部离子与脂质体分离，该步骤可能导致脂质体破裂、氨挥发或离子吸附，引起结果偏差；毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱（CE-ICP-MS）虽可替代，但仅适用于硫酸根检测，且成本高、操作复杂。因此，亟待开发一种直接、快速、准确且无需预分离的方法来量化脂质体制剂中的离子型辅料。

研究人员开发并验证了基于毛细管电泳耦合电容耦合非接触电导检测（CE-C4D）的新方法，直接定量DOX脂质体制剂中的总离子和外部离子。该方法无需样品前处理，可在约10分钟内同时分离和检测多种无机阳离子（NH₄⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺）和阴离子（Cl^–、SO₄^2-、F^–），线性相关系数均高于0.999，检测限低于3.0 μM。对五种FDA批准的脂质体DOX制剂（包括原研药Doxil及四种仿制药）的分析表明，所有制剂的脂质体内(NH₄)₂SO₄浓度均超过200 mM，满足稳定性要求。该方法为脂质体制剂的品牌与仿制药开发、质量控制和监管评估提供了可靠工具。论文发表在《ACS Omega》。

研究人员采用的关键技术方法包括：毛细管电泳（CE）分离系统耦合电容耦合非接触电导检测（C4D）实现非侵入性检测；优化背景电解质（BGE）组成（100 mM MES、78 mM L-组氨酸、146.1 mM蔗糖、3.5 mM 18-冠-6，pH 6.0）以维持脂质体完整性并实现高效分离；选用25 μm内径熔融石英毛细管，分别在正极性和负极性下分析阳离子和阴离子，添加LiF为内标；通过直接注射测定外部离子，经甲醇破坏脂质体后测定总离子，并与过滤后IC及ICP-MS方法比较。样本队列来源：五种FDA批准的脂质体DOX制剂（Doxil及四种仿制药），购自WEP Clinical。

研究结果：
- **CE分离原理**：基于电泳迁移率差异，阳离子在正极性下按NH₄⁺、K⁺、Na⁺、Li⁺顺序迁移；阴离子在负极性下按Cl^–、SO₄^2-、F^–顺序迁移。所有峰分辨率大于1.5，实现基线分离。
- **方法优化**：
- 背景电解质优化：筛选多种缓冲体系后选择MES/组氨酸/蔗糖，确定100 mM MES为最佳浓度，兼顾分析时间、灵敏度和分辨率。
- C4D优化：针对不同条件（BGE组成、浓度、电压、温度、毛细管直径）自动优化频率、振幅和前置增益。
- 毛细管内径选择：比较25、50、75 μm内径，发现25 μm内径灵敏度最高（灵敏度比为8:4:1），选用25 μm。
- 进样体积优化：随进样体积增大分辨率下降，选择50 mbar×50 s。
- 18-冠-6浓度优化：3.5 mM 18-冠-6可有效分离NH₄⁺与K⁺，且适用于高NH₄⁺浓度的脂质体样品。
- 清洗溶液优化：使用自配清洗液（EDTA、SDS和N,N-二甲基十二烷基胺N-氧化物）冲洗毛细管后，保留时间重现性显著提升。
- 其他优化：采用堆叠缓冲液（146.1 mM蔗糖+10 mM组氨酸）提高分辨率，毛细管温度保持15℃以防脂质体破裂，选用±30 kV电压，LiF作内标。
- **校准与质量控制**：方法在0.50~8.00 mM（NH₄⁺）等浓度范围内线性良好（R²>0.999），检测限低于3.0 μM，定量限低于8.22 μM。日内与日间精密度及准确度试验显示，绝大多数离子RSD<5%、Error%<1%，仅低浓度Na⁺变异稍高。
- **DOX制剂中总、外部和脂质体内无机离子的比较**：通过直接注射测定外部离子（NH₄⁺ 3.5~5.2 mM，SO₄^2- 0.3~1.2 mM），甲醇破坏后测定总离子（NH₄⁺ 9.3~12.4 mM，SO₄^2- 4.1~5.7 mM），再计算脂质体内浓度。所有制剂的脂质体内(NH₄)₂SO₄均超过200 mM。总硫酸根浓度与ICP-MS结果一致，总铵根与IC结果一致。
- **外部离子分离方法的比较**：直接注射CE-C4D测得的离子浓度略低于过滤后IC方法，提示过滤可能导致部分脂质体破裂及离子泄漏。
- **脂质体DOX制剂中无机离子分离和检测方法的比较**：CE-C4D相比IC和CE-ICP-MS，具有无需样品制备、纳升级进样、快速（~10 min）、高分辨率、环保、可与其他检测器联用等优势，但需分别分析阳阴离子，且高浓度基质下需谨慎优化。

讨论部分指出，CE-C4D方法避免了传统过滤步骤的缺点，为脂质体制剂中无机离子的准确量化提供了稳健、经济且绿色的替代方案。研究结论部分翻译如下：研究人员开发并验证了一种基于CE-C4D的方法，用于选择性定量脂质体DOX制剂中的总离子和外部离子。该方法消除了分析前额外分离步骤的需求，并展现出优异的分析性能，检测限低于3.0 μM，高精密度（RSD<5%），以及快速分析时间（约10分钟）。使用CE-C4D对五种FDA批准的脂质体DOX制剂的分析确认，所有制剂均含有足够的内部硫酸根离子（>200 mM）以将DOX保留为不溶性硫酸盐晶体。该方法简单、稳健且样品需求量小，适用于脂质体药物制剂的常规开发、质量控制、品牌-仿制药比较和监管评估。