基于表型和分子方法的耐盐小扁豆（Lens culinaris Medik.）基因型鉴定

《Frontiers in Genetics》：An integrated phenotypic and molecular approach to identify salinity-tolerant lentil (Lens culinaris Medik) genotypes

　　

土壤和灌溉水中的盐胁迫已成为全球农业生产面临的严峻挑战。小扁豆（Lens culinaris Medik.）对盐胁迫高度敏感，尤其在早期幼苗建立阶段，严重影响其生长发育。因此，苗期系统性筛选可作为鉴定新型耐盐种质的有效策略。本研究中，研究人员对来自国际干旱地区农业研究中心（ICARDA）育种计划的50份优良育种基因型进行了苗期耐盐性评价，在盐胁迫（电导率8 dS m^?1）和对照条件下通过盆栽试验进行。在播种后30天记录了包括地上部和根系长度及其生物量在内的重要形态-生理性状，结果显示存在显著的遗传变异。基于累积耐盐指数（Cumulative Salt Tolerance Index, CSTI），35份基因型被归类为盐敏感型，8份为中等耐盐型，7份为耐盐型，其中"X2018-482-S5"最为耐盐，而"FLIP2014-083L-S9"最为敏感。所选耐盐基因型进一步在盐渍田条件下进行评价，其中X2018-482-S5、ILL7547、X2011S-89-23-S1、X2011S-91-77-2-S1和ILL6819/ILL6207-S2表现出稳定的生长和产量表现，与耐盐对照PSL9和PDL1相当。基因表达分析揭示，耐盐基因型中高亲和力钾转运蛋白（High-Affinity Potassium Transporter, HKT）和NAC结构域蛋白-72（NAC domain-containing protein-72）呈协同上调表达，与敏感对照FLIP2014-083L-S9相比，在100 mM NaCl处理后6小时和12小时的转录水平显著更高，表明其增强了离子稳态和胁迫响应调控。总体而言，苗期表型鉴定、田间验证和分子分析的整合为鉴定适合盐碱环境育种计划的优良耐盐小扁豆基因型提供了有力证据。

土壤盐渍化是限制全球农业生产力的最严重非生物胁迫之一，尤其在干旱和半干旱农业生态系统中更为突出。由于气候变化、灌溉管理不当、排水不足、次生盐渍化以及地下盐水位上升，土壤盐渍化的发生正在迅速增加。小扁豆作为重要的冷季豆类作物，以其高蛋白含量、必需微量营养素以及通过生物固氮对土壤肥力的贡献而备受重视，但其对盐胁迫尤为敏感，即使在相对较低的土壤电导率水平下，发芽、幼苗建立和产量也会大幅降低，损失率可达50%至90%以上。因此，开展耐盐小扁豆基因型的系统筛选对保障粮食安全具有重要意义。

研究人员选取了50份来自ICARDA育种计划的小扁豆优良品系，包括高级育种品系、种质资源和地方品种收集材料，以及两个耐盐对照品种PDL1和PSL9。研究采用整合策略，首先在印度中央邦阿姆拉哈的ICARDA粮食豆类研究平台控制条件下进行盆栽苗期筛选，设置盐胁迫（ECe = 8 dS m^?1，80 mM NaCl）和对照处理；随后选取12份代表性基因型在印度哈里亚纳邦卡尔纳尔的ICAR-中央土壤盐渍研究所（ICAR-CSSRI）盐渍田（ECe ≈ 7 dS m^?1）进行田间验证；同时对筛选出的耐盐和敏感基因型进行HKT基因（Lcu.2RBY.2g061250）和NAC结构域蛋白-72基因的实时荧光定量PCR（qRT-PCR）表达分析。

**盐胁迫对幼苗生长和生物量的影响**：盐胁迫显著影响小扁豆幼苗生长和生物量积累。方差分析显示基因型、盐胁迫及其互作对各项指标有极显著影响（p ≤ 0.001）。在8 dS m^?1盐胁迫下，所有幼苗形态性状均较对照明显降低。平均地上部长度从21.20 cm降至15.93 cm（约降低24%），根系长度从16.45 cm降至11.42 cm（约降低30%）。生物量相关性状降幅更大，地上部鲜重降低约36%，根系鲜重降低42.1%，总鲜重降低37.9%；地上部干重降低约44%，根系干重降低约58%，总干重降低约50%。然而，不同基因型间存在显著遗传变异，耐盐基因型如X2018-482-S5、ILL7547、X2011S-91-77-2-S1等的降幅明显较小。相关分析表明，各性状间存在显著正相关，累积耐盐指数（CSTI）与所有性状高度正相关，尤其与总干重、总鲜重和地上部干重的相关系数大于0.93。

**基于耐盐指数的小扁豆基因型分类**：基于CSTI值相对于群体均值和标准差的分布，50份基因型被分为三类：盐敏感型（均值CSTI + 0.25标准差，35份，占70%）、中等耐盐型（均值CSTI + 0.25–1.25标准差，8份，占16%）和耐盐型（均值CSTI + >1.25标准差，7份，占14%）。耐盐型包括X2011S-89-23-S1、PSL-9、ILL6819/ILL6207-S2、ILL 7547、X2011S-91-77-2-S1、PDL-1和X2018-482-S5，其中X2018-482-S5的CSTI值最高（17.48）。主成分分析显示前两个主成分解释了90.7%的总变异，根系性状（根系长度、根系鲜重、根系干重）是最主要的贡献因子。聚类分析将50份基因型分为三个聚类，与CSTI分类高度一致，进一步验证了分类结果的可靠性。

**耐盐小扁豆基因型的田间验证**：在盐渍田条件下，方差分析显示基因型、盐胁迫及其互作对大多数表型、产量和离子性状有极显著效应。盐胁迫使各基因型的农艺和产量性状总体降低，但耐盐基因型表现更为稳定。X2011S-91-77-2-S1的产量最高（1,386 kg ha^?1），超过对照PDL-1（1,153 kg ha^?1）20.2%和PSL-9（1,106 kg ha^?1）25.3%；ILL6819/ILL6207-S2产量为1,190 kg ha^?1，超过PSL-9达7.6%。ILL 7547和X2018-482-S5的产量与对照水平相当。耐盐基因型还保持了较高的生物学产量和荚果数。值得注意的是，苗期表现中等耐盐的ILL813/4605/1-2-S1-S87在田间生殖期表现出高度敏感，产量降幅达54.66%，应力敏感性指数（SSI）高达1.63，表明其耐受性不稳定。在离子积累方面，耐盐基因型表现出较低的Na⁺积累和Na⁺/K⁺比值，其中X2011S-91-77-2-S1的地上部Na⁺/K⁺比值最低（0.76），地上部Na⁺为25.5 mg g^?1，地上部K⁺为33.6 mg g^?1，表现出优越的离子稳态。籽粒产量与Na⁺含量（地上部和根系）呈显著负相关（r = ?0.93^***）。

**关键耐盐基因的表达动态**：基因表达分析显示，在100 mM NaCl处理后，耐盐基因型和对照PDL-1中HKT和NAC结构域蛋白-72基因均较敏感对照FLIP2014-083L-S9显著上调表达。NAC基因在6小时时于耐盐基因型中快速诱导表达，随后在12小时时呈基因型依赖性调节，X2011S-91-77-2-S1在12小时时表达峰值最高。HKT基因表现出更为显著的上调，6小时时X2018-482-S5表达最高，紧随其后的是PDL-1和X2011S-89-23-S1；12小时时所有耐盐基因型的表达进一步增加，PDL-1和X2018-482-S5的上调幅度最大。耐盐基因型的表达水平始终高于敏感对照，且从6小时到12小时呈明显的时间递增趋势。

**讨论**：研究人员强调，小扁豆对盐胁迫的敏感性在萌发、早期幼苗建立和生殖期最为突出，苗期表型筛选是鉴定耐盐基因型的实用可靠策略。盆栽控制环境筛选能够统一施加胁迫条件，有效揭示生理变异，而田间验证对于确保耐受性稳定性不可或缺，因为基因型×环境互作显著影响表型表达。X2011S-91-77-2-S1、ILL6819/ILL6207-S2和X2018-482-S5等基因型在盆栽和田间条件下均表现稳定，表明其整合了多种耐受机制，包括高效渗透调节、Na⁺排除和细胞稳态维持。根系性状在耐盐性中具有核心作用，因其直接暴露于胁迫环境并介导离子吸收和水分平衡。在分子层面，NAC转录因子通过调控渗透调节、抗氧化防御和细胞保护相关下游基因网络发挥作用，而HKT转运蛋白通过回收木质部Na⁺限制其向地上部转移，维持Na⁺/K⁺稳态。这两种基因的协同激活表明耐盐基因型具有"早期胁迫感知-下游离子调控"的整合耐受机制，为田间水平耐盐性提供了分子层面的解释。

**结论**：本研究在小扁豆苗期和田间水平均证实了耐盐性的显著遗传变异，揭示了盐胁迫响应的复杂多维度特性。盐胁迫显著降低生长、生物量和产量相关性状，但耐盐基因型在胁迫条件下保持较高表现。盆栽筛选与田间验证的整合有效鉴定了真实盐碱环境中的稳定高产品种。X2018-482-S5、X2011S-91-77-2-S1、ILL7547、ILL6819/ILL6207-S2和X2011S-89-23-S1等优良基因型代表了宝贵的遗传资源，可用于面向盐碱农业生态系统的育种计划。研究强调，有效的耐盐性选择应整合早期阶段筛选、田间验证以及生理和分子特性分析，以确保在盐胁迫条件下的稳定表现。