综述：纳米技术驱动的等温扩增诊断技术演进

《Bioscience Nanotechnology》：Nanotechnology-driven evolution of isothermal amplification diagnostics

　　

纳米技术与核酸等温扩增（Isothermal Amplification, IA）的融合正在重塑分子诊断的格局，架起了实验室精度与现场检测之间的桥梁。与传统基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）的检测方法不同，IA技术在恒定温度下操作，能够实现快速、灵敏且选择性的核酸检测，并可配备便携式甚至无需仪器的设备。纳米材料，包括磁性纳米粒子（Magnetic Nanoparticles, MNPs）、金纳米结构以及二维材料等，目前正在增强IA系统方面发挥关键作用。它们通过磁提取实现高效的样品制备，在非理想条件下稳定酶促反应，并作为高响应性换能器产生光学或电化学信号。纳米材料的整合还催生了先进的检测形式，从侧向层析试纸条和微流控芯片到智能手机耦合及CRISPR辅助生物传感器。这些混合平台将高灵敏度和特异性与即时检测（Point-of-Care, POC）或资源有限环境所需的简便性相结合。尽管标准化、可重复性和规模化生产方面仍存在挑战，但纳米辅助IA的分析优势，如加速工作流程、多重检测能力和定量便携性，使这一融合成为下一代诊断设备的基石。本综述考察了纳米材料与IA协同作用的最新进展、分析意义和未来转悠前景，强调了其在可及、快速和公平的分子检测方面的变革潜力。

引言

核酸等温扩增（IA）技术已迅速演变为现代分子诊断中最重大的突破之一。近截稿，由于对快速、灵敏且可现场部署的核酸检测系统的需求日益增强，这一技术得到了进一步发展，其驱动力包括全球卫生紧急情况、分散式检测的兴起以及对精准医学的日益重视。传统的聚合酶链式反应（PCR）以及现代qPCR和RT-qPCR技术，虽然被视为核酸扩增的金标准，但其依赖于精确的热循环和精密的实验室基础设施，这限制了其应用范围。这些限制催生了在简化操作条件下实现相当分析性能的等温扩增策略。事实上，尽管PCR、qPCR和RT-qPCR取得了进展，但等温扩增反应在恒定温度（如25°C、37°C或65°C）下进行，从而消除了热变性步骤的需要，并将检测时间从数小时缩短至数分钟。这种操作简便性消除了对笨重且耗能的实验室基础设施的需求，使得反应仅需最简单的设备（如简易加热块）即可进行。此外，IA化学对抑制剂的耐受性优于PCR方法。标准qPCR通常需要经过繁琐提取获得的高纯度模板，而纳米辅助IA在唾液、全血和污水等粗提生物基质中仍能保持高分析性能。这种稳健性结合更快的周转时间（通常15-30分钟即可获得结果，而标准实验室技术需要数小时），使IA特别适用于即时检测（POC）环境。

多种不同的IA机制已被建立，包括环介导等温扩增（Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）、重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）、基于核酸序列的扩增（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA）和解旋酶依赖性扩增这是怎么回事（Helicase-Dependent Amplification, HDA）。这些技术基于独特的酶促途径实现快速、灵敏且可特异性检测的信号，展现出操作简便性和便携性，反应仅需最简单的设备（简易加热块或便携式孵育器）即可完成，使其适用于POC诊断、资源有限环境和疫情应对场景。

IA的多功能性使其被整合入广泛的分析应用中，包括医院获得性感染、SARS-CoV-2、HIV以及寨卡和登革等病毒，兽医和农业检测，肿瘤学和遗传筛查，以及环境和食品安全监测等领域。此外，IA与微流控和芯片实验室平台的最新融合，以及先进换能技术的发展，为实时、微型化和数字化连接的诊断系统铺平了道路，同时结合人工智能（AI）和机器学习（Machine Learning, ML）。得益于这些多学科分支的结合，IA辅助生物传感器正在对公共卫生和诊断产生深远影响，成为下一代诊断范式的基石，并架起了实验室检测与POC分析之间的桥梁。

然而，尽管等温扩增技术取得了显著进展，若干技术限制仍然阻碍其在分散式诊断中的广泛部署。这些限制包括需要先进的酶工程和引物设计以增强反应稳健性，开发具有改进保真度和热稳定性的链置换聚合酶，以及优化重组酶和解旋酶系统以拓展等温反应的操作范围。特别值得注意的是，在室温下高效工作的酶的鉴定将消除温度控制需求，实现真正的无需仪器检测。

一个新兴方向在于等温扩增与纳米技术的结合。纳米材料独特的理化性质（如金纳米粒子、磁性纳米粒子、石墨烯和MXenes等二维材料、聚合物纳米载体以及催化性纳米酶）能够实现生化微环境的精细调控，从而改善酶稳定性、增强热传递并保护粗提样品中的抑制剂。例如，金纳米粒子可通过防止变性或聚集来稳定聚合酶和重组酶，延长试剂保质期并确保在波动环境条件下的稳定活性。类似地，磁性纳米粒子能够实现快速且无需仪器的核酸提取和浓缩，最大程度减少样品损失和基质干扰。此外，热导纳米结构能够在小体积反应中均匀化温度分布，确保即使在微型化或便携式设备中也能实现均匀的扩增动力学。除反应优化外，纳米材料还可通过光学、电化学或等离激元换能系统促进扩增与检测的集成。

根据最新文献，纳米材料正成为基于IA诊断技术演进中不可或缺的元素。它们的整合正从根本上扩展其分析多功能性，贡献于分析工作流程的几乎每个步骤。事实上，它们可通过高效的核酸提取和浓缩促进样品制备，通过稳定酶和改善热均质性增强扩增反应，并通过比色、等离激元或电化学响应介导信号转导，从而实现直观且无需仪器的读数。此外，它们在微流控和侧向层析格式中的整合有助于实现自主便携式系统。

纳米辅助IA诊断

纳米材料在样品制备中的作用

高效的样品制备仍是基于核酸的诊断工作流程中的主要瓶颈之一，尤其对于IA平台，其反应稳健性强烈依赖于模板质量。常规提取方案通常涉及细胞裂解、酶消化、多次离心步骤、基于柱的固相提取以及重复的洗涤/洗脱循环。虽然这些方法已较为成熟，但劳动密集、耗时且依赖于实验室级仪器设备，这限制了其整合入分散式、POC或可现场部署的诊断系统。此外，转移步骤中的样品损失和不完全的抑制剂去除可能显著影响分析灵敏度，尤其当涉及低丰度靶标时。

纳米材料提供了一种通用且可扩展的解决方案来解决这些局限性，通过实现裂解、捕获、浓缩和纯化的集成化简化工作流程。由于具有高比表面积和可调控的理化性质，纳米材料提供了增强的结合能力和快速的质量传递动力学，从而缩短提取时间并提高回收效率。其纳米级尺寸促进了与核酸的紧密相互作用，包括静电作用、氢键、疏水作用或序列特异性杂交，具体取决于表面功能化。

纳米材料辅助提取的关键优势在于其能够选择性富集核酸，同时去除扩增抑制剂，如血红蛋白、尿素、多糖、腐殖酸、蛋白质和盐类。这种选择性纯化对于IA化学尤为重要，后者虽然高效，但在非理想条件下可能对基质来源的抑制剂更为敏感。通过改善模板纯度，纳米材料直接有助于增强扩增动力学、降低背景噪声并改善可重复性。

表面工程在调控纳米材料性能方面发挥核心作用。通过硅烷基团、羧基或胺基、聚乙二醇（PEG)或序列特异性寡核苷酸等功能化，可调节结合亲和力、选择性和与下游酶促反应的兼容性。此外，刺激响应性涂层（如pH或温度敏感性聚合物）可实现可控的结合和释放机制，促进最小人工干预的简化工作流程。

在可用平台中，磁性纳米粒子（MNPs）对诊断应用尤为有吸引力。通常由氧化铁核心（如Fe₃O₄或γ-Fe₂O₃）和功能化壳层组成，MNPs结合了高比表面积和快速磁响应性。这使得能够直接从复杂基质（如全血、唾液、尿液、食品样品或环境水）中高效捕获核酸，并通过磁分离实现无需离心的分离。洗涤和洗脱步骤可使用简单的磁架或集成微流控磁体完成，使该过程兼容于便携式和自动化系统。

此外，基于MNP的提取可无缝整合入芯片实验室设备和封闭卡盒系统，降低污染风险并实现全自动化的样品到答案平台。在某些实现方案中，磁珠上捕获的核酸可直接引入IA反应而无需洗脱，进一步减少损失并缩短周转时间。

总体而言，纳米材料辅助的样品制备不仅提高了核酸产量和纯度，还促进了工作流程的简化、微型化和自动化。这些特性使纳米材料成为开发快速、灵敏且可部署的IA诊断系统的关键使能技术。

用于酶稳定的纳米材料

除在样品制备中的作用外，纳米材料还被越来越多地用于稳定关键酶并增强IA反应的动力学和稳健性。IA平台依赖于高活性的生物分子，包括DNA聚合酶、逆转录酶、重组酶和解旋酶，其性能可能被残留抑制剂、非理想离子强度、pH波动或现场部署格式中的热不稳定性所损害。金纳米粒子（AuNPs）由于其高比表面积和可调控的表面化学，能够产生保护性的纳米界面，减少酶变性、聚集和非特异性吸附至反应容器。通过共价或亲和性偶联（如巯基-金或碳二亚胺介导的酰胺偶联），酶或引物可被固定同时保留催化活性，从而改善储存稳定性和抗蛋白水解降解能力。

酶固定化提高了可重复使用性、稳定性和催化效率。特别是通过明确的官能团与固体支持物的共价连接（如通过碳二亚胺偶联或巯基-金相互作用）提供了稳定的锚定，在延长储存和重复使用中保持酶活性。此外，固定化创建了更接近活细胞中酶 Kin的的自然组织状态的异相系统，其中酶通常与膜或细胞内结构相关联。这种结构限制可增强酶稳定性及对环境波动（如pH、温度和蛋白水解降解）的抗性，从而提高检测可靠性和可重复性。然而，固定化可能导致分子可及性降低、影响靶标结合的空间位阻以及反应动力学的可能改变。尽管如此，这些效应高度依赖于固定化策略、表面化学和连接子设计。因此，在IA的背景下，固定化在稳定性、可重复性和稳健性至关重要的应用中提供了切实优势，而相关局限性可通过精心的系统设计加以控制。

碳基纳米材料如氧化石墨烯和碳纳米管，以及包括MXenes在内的新兴二维材料，通过在小体积系统中提供高导热性和高效的热耗散，进一步促进了反应增强。此外，纳米材料表面与核酸之间可控的吸附-解吸动力学可促进反应物的局部浓度，有效提高反应速率。纳米酶——表现出酶模拟催化活性的工程化无机纳米结构——也正在被研究作为IA检测中生物学酶的稳健替代物或补充物。其对极端pH、温度波动和长期储存条件的内在抗性，使其对于开发试剂稳定、不依赖冷链的分散式和资源有限环境下的诊断平台尤为吸引。

用于信号转导和反应增强的纳米材料

虽然IA方法产生核酸扩增子，但将其转化为诊断读数依赖于灵敏、快速且便携的信号换能系统。纳米材料独特地适合承担这一角色：金属纳米粒子（如金、银纳米粒子）和二维材料（如石墨烯、MoS₂、MXenes）可提供增强的光学和电化学性质来放大检测信号。

例如，Au和AgNPs在增强与等温扩增相关的光学和电化学换能中的信号转导方面发挥关键作用。其卓越的光学和电学性质使其成为将分子识别事件转化为可测量信号的强大换能器。

在光学生物传感器中，Au和AgNPs可增强荧光、拉曼或比色响应，或通过能量转移机制作为淬灭剂。金纳米粒子的整合已从根本上重新定义了IA的性能，从被动的视觉辅助进化为酶促和动力学调控的复杂工具。早期策略主要利用AuNPs的光学性质在POC环境下提供病原体的快速裸眼检测。这些研究强调了AuNPs在改善信噪比和实现侧向层析生物传感器（LFB）等现场部署格式中的重要性。特别是，AuNPs通过局域表面等离激元共振（LSPR）提供了鲜艳的红色读数，肉眼清晰可见，消除了对昂贵且耗时的实验室设备（如分光光度计或荧光读数器）的需求。

Xiao等人开发了将LAMP与基于纳米粒子的LFB集成的现场可部署诊断检测。该系统能够在64°C恒定温度下绕开传统PCR的复杂性，实现快速（1小时）和高灵敏度（每反应仅5个DNA靶标拷贝）检测。研究人员使用链霉亲和素-生物素功能化的AuNPs作为具有独特LSPR的光学报告分子。通过用AuNPs装饰LAMP扩增子，系统有效放大了物理信号，提供了肉眼可见的清晰红色条带，从而消除了对紫外透射仪或荧光检测器的需求。此外，纳米粒子标记的探针确保只有成功扩增的靶标DNA产生信号，降低了非特异性引物二聚体导致假阳性的风险。

Carlos等人提出了IA诊断中的关键进展，将LAMP与非功能化AuNPs协同结合。在这种情况下，研究人员使用AuNPs作为比色报告系统，依赖于溶液中金胶体的稳定性。靶标扩增产生高产量的dsDNA，作为AuNPs的保护盾。在阴性反应中，NaCl的加入中和了纳米粒子之间的排斥电荷，导致其聚集，从而产生红到蓝的颜色变化。而在阳性反应中，丰富的DNA阻止了这种聚集，保持溶液的红色。该系统可作为是/否视觉读数，使其无需荧光检测器即可用于POC应用。此外，未修饰AuNPs的使用降低了化学复杂性和试剂降解的可能性，增强了检测在现场条件下的可靠性。

Ye和Chen等人证明AuNPs通过与酶-模板复合物的相互作用作为特异性增强剂。他们的研究证明AuNPs可有效抑制非特异性引物二聚体形成并最小化错配延伸，从而将SNP诊断的准确性提升到先前仅通过高分辨率熔解或测序才能达到的水平。这种纳米增强不仅限于LAMP；Sedighi等人开发的Nano-HDA突出了AuNPs在促进解旋酶介导的链分离方面的多功能性，尤其在复杂基质中。

Xiang等人描述了一种将HCR与AuNPs结合的无酶比色平台设计。在这种情况下，靶标DNA触发了HCR级联以形成长dsDNA聚合物，与初始发夹不同，其无法稳定AuNPs抵抗盐诱导的聚集。由此产生的红到蓝颜色变化允许对靶标进行视觉识别，检测限低至皮摩尔范围，为传统酶促检测提供了简单、低成本的替代方案。

Xie等人最近介绍了一种基于LAMP-AuNP-LFB的诊断检测，设计用于致病性钩端螺旋体属的快速视觉鉴定。该生物传感器能在45分钟内靶标lipL41基因，在67°C恒定温度下操作，从而消除了对复杂热循环仪的需求。结果展示了高灵敏度，每测试可检测少至5个拷贝的靶标基因，且无交叉反应性。在这种情况下，使用AuNPs作为高性能信号换能器，能够将复杂的实验室程序转化为高效的现场可部署诊断工具。

Wang等人开发了一种将功能化AuNPs与LAMP整合的视觉核酸检测平台。这里，纳米粒子用聚乙二醇（PEG）和羧基进行功能化，专门设计用于在DNA扩增所需的高盐环境中保持稳定。这些纳米材料作为精密的信号剂与焦磷酸镁（LAMP反应的产物）相互作用。随着靶标DNA的扩增，产生的焦磷酸盐晶体捕获修饰的纳米粒子，导致可见的共沉淀。因此，阳性结果由红色分散溶液向底部有红色沉淀的澄清液体的转变来指示。

在电化学生物传感器中，Au和AgNPs作为导电界面改善电子转移效率并放大电流响应，得益于其高比表面积和催化活性。

Qu等人也证明了AgNPs在液体活检中突变鉴定方面增强生物传感器灵敏度的卓越能力，这些突变常被大量健康DNA背景所掩盖。该生物传感器基于DNA纳米机器和阳离子交换反应，将痕量的循环肿瘤DNA（ctDNA）转化为强大的电信号。通过利用银离子介导的纳米球，系统在识别EGFR L858R突变时触发初级扩增，随后释放高密度银离子。这些离子然后通过CuS纳米粒子的阳离子交换参与次级扩除阶段，释放作为最终电化学信使的铜离子。

除金属NPs外，另一高影响领域涉及磁性和石墨烯基纳米材料在工作流程优化中的应用。如He和Tang等人开发的用于利什曼原虫的磁金双标记引物，磁性纳米粒子不仅加速了从复杂基质中提取和纯化DNA，还能整合入电化学系统以实现样品到结果的自动化过程。同时，Zhang等人分析的GO的使用，使研究人员能够利用这些材料的卓越淬灭和吸附能力来抑制非特异性背景，并为COX2 mRNA等生物标志物开发高灵敏度的开启型荧光检测。

Orsini等人最近配置了一种使用MNPs的荧光生物传感器，利用包含条状微磁铁阵列的专用18腔室卡盒。该系统围绕功能化纳米材料与双标记DNA扩增产物之间的相互作用设计。这种配置使分析仪能够捕获高对比度图像，其中信号集中在清晰的荧光条带中，有效地将靶标分析物与溶液的背景噪声分离。在这种情况下，这种纳米材料的优势在于靶标扩增产物的磁定位，实现了荧光标记DNA与原位非结合引物的物理分离。

Li等人开发了一种基于MNP驱动RPA扩增的生物传感器，用于快速同时检测两个特异性线粒体基因（马ATP6-8和鸡细胞色素b CYTB），应用于食品安全领域。该系统将RPA扩增步骤与使用链霉亲和素包被的核壳Fe₃O₄@SiO₂纳米粒子捕获双标记扩增产物的分离阶段相整合。这种配置在有效降低背景噪声、增强信噪比、特异性和灵敏度方面提供了显著优势，适用于高通量、现场可部署的设置。

量子点的使用也为等温扩增生物传感器带来了巨大优势。Wang等人描述了一种LAMP平台设计，用于在单一反应中同时检测多种食源性病原体，使用具有不同光致褪色抗性的QDs作为信号标签。通过将不同靶标配置具有不同光漂白动力学的特异性QDs，所述系统能够通过虚拟通道方法在单一荧光通道内区分多种分析物，绕过了传统多色检测的光谱重叠限制。

Zeng等人提出了一种集成RPA扩增和CRISPR-Cas12a技术的LFA生物传感器，用于大肠杆菌O157:H7和单核细胞增生李斯特菌的双重检测。转导系统依赖于基于荧光的读数，其中Cas12a的反式切割活性被靶标DNA触发，导致特定报告探针的降解。核壳QDs专门用作侧向层析条带上的荧光标签，在激发时提供高强度信号，实现了卓越的光稳定性和高量子产率。

用于即时检测的纳米-IA系统

实现真正分散式诊断的最后一步在于将纳米材料辅助的IA系统集成到便携、自动化且易于使用的设备中。近年来，纳米技术、微流控和低成本的电子设备的融合为样品到答案系统铺平了道路，这些系统能够在单一封闭卡盒中执行核酸提取、扩增和检测。

Wei等人报道了分子诊断中的重要进展，开发了一种用于病毒核酸检测的等离激元增强数字化生物传感器。该研究利用纳米结构化金表面（包含金盘纳米阵列）作为等离激元基底。这种纳米材料架构至关重要，因为它创造了局域电磁场增强，显著放大了LAMP反应期间产生的扩增产物的荧光信号。该系统能够达到1 copy/μL的卓越检测限，匹配数字PCR的灵敏度，同时保持等温过程的速度和简便性。

Guo等人描述了将Ti₃C₂T_x MXene纳米片整合入RPA辅助平台的配置，用于通过位点特异性酶识别整合快速灵敏地检测DNA甲基化水平。检测通过荧光淬灭-恢复机制实现，其中甲基化靶标DNA的存在产生扩增级联，调制光学信号。纳米材料由于其广泛的金属吸收和对单链DNA探针的强亲和力，作为高效淬灭剂。

纳米辅助IA中的分析挑战与技术融合

根据报道的文献，纳米技术已在基于AI的诊断开发中实现了重大进展。纳米材料影响表面化学以及光学、磁性和电子性质。通过与功能纳米结构的扩增反应接口，即使在复杂的生物基质中，灵敏度、反应动力学和扩增也得到了改善。

然而，尽管取得了显著进展，几个分析挑战仍需解决才能使IA诊断实现商业转化。高表面反应性、可调光学和电子性质以及纳米级异质性虽可作为分析增强器，但同时也是可引入变异性和复杂性从而影响可重复性和验证的因素。另一个关键挑战涉及纳米材料合成和表面功能化的批间可重复性。粒径、表面电荷或配体密度的微小变化可改变结合动力学和光学/电化学响应，从而影响可靠性。

信号校准和定量是另一重大问题。基于视觉输出的比色检测缺乏定量解释的效率，且照明、相机分辨率或环境条件的变化可影响信号线性。电化学检测确保稳定的基线并最小化非特异性吸附，但可能无法提供与PCR相当的灵敏度和准确性。生物相容性和法规合规性也代表了临床应用的障碍。纳米材料的长期稳定性和潜在细胞毒性需要仔细评估。此外，集成入封闭系统卡盒必须防止扩增子污染并满足诊断认证所需的生物安全标准（如ISO 13485, FDA 510(k)）。最后，广泛应用将需要使用真实世界临床基质（血液、唾液和污水）的大规模验证和实验室间比较研究。

未来展望方面，IA与纳米技术、微流控和数字智能的融合，可支持分散式POC监测系统的发展。新兴研究趋势指向多功能纳米材料的使用，能够同时支持样品制备、稳定酶促反应，并通过光学或电化学领域传输信号。混合纳米结构，如等离激元-磁性复合材料、MXene-石墨烯异质结构或聚合物-金属纳米酶，正被越来越多地设计以结合生物化学识别与可靠的信号生成。

纳米辅助IA诊断中的主要优势与局限性

纳米材料整合入IA诊断的优势与局限性可系统总结如下。优势方面包括：加速工作流程，将检测时间从数小时缩短至30分钟以内；提高灵敏度，检测限可达1-5拷贝，媲美PCR；实现仪器-free或最小仪器的现场检测；支持多重检测能力；增强对粗提基质的稳健性；以及通过比色、荧光或电化学信号实现直观的信号读数。局限性方面包括：纳米材料合成的批间变异；表面功能化的可重复性挑战；需要标准化方案；长期储存稳定性问题；潜在的纳米材料毒性担忧；法规批准路径的不确定性；以及从实验室到商业规模生产的转化障碍。

结论

综述文献的集体证据表明，纳米技术与等温扩增的协同作用已成功解决了简单性与敏感性之间的传统权衡。虽然胶体金纳米粒子为资源有限环境中的疫情监测提供了即时解决方案，但纳米结构化表面和磁性富集的整合正在将等温平台转变为高精度定量工具。未来研究应优先混合这些功能，将磁制备、纳米增强特异性和数字读数整合入单一集成设备。为此，下一代生物传感器可能将专注于一体化平台，结合磁性纳米粒子进行快速样品制备与纳米结构化表面进行数字读数，消除目前阻碍许多POC设备的样品到结果瓶颈。为推动可持续性和稳定性，未来研究应优先使用环境友好型纳米材料和开发干试剂形式，利用纳米载体的稳定性质，确保诊断试剂盒在极端气候下无需冷链即可保持功能。为实现商业可扩展性，实验室原型需要实现向大规模生产的转化。纳米制造技术的标准化，如金纳米盘的大规模图案化或均匀MXene薄片的合成，将对这些纳米增强IA系统的商业成功至关重要。总而言之，纳米技术与等温化学的协同作用已将领域从实验性概念验证推进到稳健的、可现场部署的工具。