《Transboundary and Emerging Diseases》：Development of a Blocking ELISA for the Serological Diagnosis of Getah Virus
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盖他病毒（Getah virus, GETV）是一种新出现的虫媒病毒（arbovirus），因其可感染猪及其他动物而对养猪业构成日益严重的威胁。然而，目前缺乏有效的猪用GETV疫苗和商品化诊断工具，这阻碍了该病的防控努力。在该项研究中，研究人员利用哺乳动物细胞
盖他病毒（Getah virus, GETV）是一种新出现的虫媒病毒（arbovirus），因其可感染猪及其他动物而对养猪业构成日益严重的威胁。然而，目前缺乏有效的猪用GETV疫苗和商品化诊断工具，这阻碍了该病的防控努力。在该项研究中，研究人员利用哺乳动物细胞系统表达重组GETV E2蛋白以保持其天然构象和抗原性，并通过免疫小鼠制备了单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）。利用GETV E2蛋白和辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记的mAbs，研究人员成功建立了一种快速、特异的阻断ELISA（blocking ELISA）用于GETV的血清学检测。该检测方法在特异性、可重复性以及与参考免疫荧光分析（immunofluorescence assay, IFA）的一致性方面进行了全面评价，显示出可靠的诊断性能。在临床评价中，462份样本的阳性率为12.121%，证实了其实际应用价值。这种新型阻断ELISA为疫苗开发和流行病学调查提供了有价值的工具，有助于制定更有效的GETV防控策略。
**研究背景与意义**
盖他病毒（GETV）是一种单股正链RNA病毒，属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus），主要通过蚊媒传播。该病毒于1955年首次在马来西亚的库蚊（Culex spp.）（云南省某医院se xian）中分离获得。长期以-se que 该病毒主要从蚊类中分离，直到1978年日本茨城县马群暴发疫情时首次在哺乳动物中鉴定出GETV。此后，GETV在猪、穿山甲、蝙蝠、小熊猫（Ailurus fulgens）、红腹树松鼠和狐狸等多种宿主中被报道，并已扩散至亚洲、欧洲和大洋洲，对动物健康和畜牧业构成日益严重的威胁。
GETV感染可导致动物出现抑郁、震颤、腹泻、发热、厌食、繁殖障碍及垂直传播等症状。2017年中国湖南省发生的严重疫情导致超过200头仔猪死亡、150余头母猪繁殖失败，组织病理学检查证实病毒具有致病性。此外，GETV可穿越胎盘屏障并损害雄性生殖功能。目前尚无特异性抗病毒治疗方法，虽有基于1978年毒株的马用疫苗，但未能提供充分保护。因此，在缺乏有效疫苗和治疗手段的情况下，准确可靠的诊断方法对于控制GETV至关重要。
GETV编码五种结构蛋白：衣壳蛋白（capsid）、E3、E2、6K和E1蛋白。其中，E2糖蛋白在病毒吸附宿主细胞、促进感染过程中发挥关键作用，且在中国毒株中高度保守，是诊断和疫苗开发的理想靶标。为开发灵敏的血清学检测工具，研究人员基于E2糖蛋白建立了阻断ELISA方法。
**技术方法**
该研究采用HEK-293F哺乳动物细胞表达系统表达重组E2蛋白，通过Strep-tag亲和层析纯化；免疫BALB/c小鼠后，利用杂交瘤技术制备E2特异性单克隆抗体；经筛选获得单克隆抗体5G并进行HRP标记；以免疫荧光分析（IFA）作为参考标准，通过棋盘滴定优化阻断ELISA的反应条件；采用ROC曲线分析确定 cutoff 值并评价诊断敏感性和特异性；收集462份临床猪血清样本（2022年至2023年中期，华中农业大学动物疾病诊断中心）进行流行病学调查。
**研究结果**
**3.1 重组GETV E2蛋白的制备**：利用HEK-293F细胞成功表达并纯化重组E2蛋白。SDS-PAGE分析显示目标蛋白条带位于约45.28 kDa处，纯度较高。Western blot分析证实该蛋白可与抗GETV E2的多克隆抗体发生特异性反应。
**3.2 GETV E2单克隆抗体的制备与鉴定**：经过两轮有限稀释亚克隆，获得7株阳性杂交瘤细胞，命名为1D、2C、3F、5G、10B、11D和11E。基于生长特性和抗体产量，选择1D、3F和5G进行后续实验。亚型鉴定显示1D和5G属于IgG1亚类，3F为IgG2b亚类，轻链均为κ型。Western blot分析显示3F和5G强烈识别重组E2蛋白，而1D无反应性。IFA结果表明三株mAbs均能与GETV-YL感染的PK-15细胞发生特异性反应，且在瞬时转染E2表达质粒的293T细胞中可特异性识别E2蛋白。
**3.3 阻断ELISA用mAbs的筛选**：三株候选mAbs经阻断效率和抗体滴度评价，mAb 5G表现出最佳结合效率，被选为建立阻断ELISA的最适抗体。
**3.4 阻断ELISA的标准化及cutoff值的确定**：通过棋盘滴定确定最优反应条件：包被抗原浓度0.0625 μg/mL，4°C孵育12 h；5% BSA 37°C封闭1 h；血清样本1:1稀释，37°C孵育1 h；HRP标记mAb 1:10,000稀释，37°C孵育30 min；TMB底物37°C反应10 min。利用22份GETV阳性血清和90份阴性血清进行检测，ROC分析显示AUC为1.000（95%置信区间：0.989–1.0），表明该方法可完美区分阳性和阴性样本。确定PI<40%为阴性，PI≥50%为阳性，40%–50%为可疑。
**3.5 阻断ELISA的分析特异性**：检测非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪瘟病毒（CSFV）、日本脑炎病毒（JEV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、伪狂犬病病毒（PRV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性血清，结果显示仅GETV阳性血清呈现高PI值，与其他病毒阳性血清无交叉反应。
**3.6 阻断ELISA的重复性**：10份GETV抗体阳性血清和8份阴性血清用于评价重复性。批内变异系数（CV）范围为0.395%–9.767%，批间CV范围为0.0716%–7.749%，均低于10%的可接受标准，表明该方法具有良好的重复性。
**3.7 阻断ELISA的临床应用**：462份2022年至2023年夏季采集的临床猪血清样本中，56份（12.121%）为阳性，26份（5.628%）为可疑，380份（82.251%）为阴性，证实该方法适用于田间样本的GETV抗体检测。
**讨论与结论**
该研究开发的GETV E2阻断ELISA具有高特异性、高灵敏度和良好的可重复性，在中国猪群中的血清阳性率为12.121%，证实了GETV在田间的持续传播。该研究为兽医诊断领域提供了标准化的血清学监测工具，填补了GETV诊断方法的关键空白。
E2作为靶标抗原具有显著优势：其高度保守的特性和免疫显性特征使其能够广泛检测不同毒株，同时最大限度减少交叉反应。与既往使用衣壳蛋白或部分E2片段的研究相比，全长真核表达的E2蛋白保持了天然折叠，有利于产生构象敏感性单克隆抗体。值得注意的是，mAb 1D在IFA中呈阳性而在Western blot中无反应，强烈提示其识别的是SDS-PAGE过程中被破坏的构象表位，凸显了抗原构象在检测方法设计中的重要性。
该方法的局限性包括潜在抽样偏差以及需要进一步开展田间验证。未来研究应进行分层抽样和多中心前瞻性评估，将监测范围扩展至其他易感家畜，整合流行毒株的分子特征分析，并开展纵向研究和田间验证以增强该方法在暴发管理和疫苗评价中的应用价值。
**研究结论**：该研究建立了一种灵敏、特异、可重复的GETV阻断ELISA MAIN xe 为GETV抗体检测提供了快速、可扩展的方法，是流行病学监测和暴发应对的宝贵工具。当前工作的不足在于缺乏E2蛋白抗原决定簇的表位定位（epitope mapping）。未来研究应着重鉴定线性B细胞表位并评价mAbs的中和能力，以深化对GETV免疫学的理解，推动诊断能力和靶向疫苗的理性设计，最终提升对该新发虫媒病毒威胁的诊断和预防策略。
