前边缘皮层神经元中STING调控内质网自噬参与神经病理性疼痛及情绪共病的发生发展

《CNS Neuroscience & Therapeutics》：STING Modulating ER-Phagy in the Prelimbic Cortex Neurons Contributed to Neuropathic Pain and Emotional Comorbidity

　　

背景：研究人员既往数据提示自噬(autophagy)对神经病理性疼痛(neuropathic pain, NP)至关重要，不同细胞类型及STING（刺激因子干扰素基因stimulator of interferon genes）调控程度差异可导致NP模型中对疼痛与情绪产生矛盾效应，目前尚不清楚STING是否通过内质网自噬(endoplasmic reticulum-phagy, ER-phagy)调控前边缘皮层(prelimbic cortex, PrL)神经元中的神经病理性疼痛。方法：本研究评估前边缘皮层(PrL)内质网自噬(ER-phagy)对神经病理性疼痛的影响。研究人员向脊神经结扎(spinal nerve ligation, SNL)小鼠PrL给予4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid, 4-PBA)、衣霉素(tunicamycin, TM)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)及雷帕霉素(rapamycin, RAP)，以评价内质网(ER)应激与自噬在SNL模型PrL中的相互作用；注射腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)探究ER-phagy是否调控疼痛及情绪行为；进一步探索STING及其通路是否作为ER-phagy参与疼痛过程的调控靶点；向SNL小鼠给予2′3-cGAMP及RU521以调控SNL模型中ER-phagy相关的cGAS/STING通路；此外通过PrL区AAV注射调控STING表达及ER-phagy水平，并检测PrL神经元中STING与LC3（微管相关蛋白1轻链3，microtubule-associated protein 1 light chain 3）的相互作用。结果：数据显示ER-phagy通过cGAS/STING通路减轻SNL所致PrL过度内质网(ER)应激；通过AAV工具调控PrL神经元ER-phagy可改变疼痛及情绪相关行为；调控PrL神经元STING可改变疼痛与情绪共病；重要的是，PrL神经元中STING与LC3的结合相互作用为PrL区ER-phagy提供了新靶点。结论：增强SNL小鼠PrL神经元ER-phagy可通过调控STING产生镇痛、抗焦虑及抗抑郁效应。

论文解读：《STING Modulating ER-Phagy in the Prelimbic Cortex Neurons Contributed to Neuropathic Pain and Emotional Comorbidity》

一、研究背景与立项依据

神经病理性疼痛（neuropathic pain, NP）常伴发焦虑、抑郁等负性情绪障碍，增加治疗难度且临床需求尚未满足。前边缘皮层（prelimbic cortex, PrL）属痛觉上行及下行系统的皮层节点，在NP及共病抑郁中发挥关键作用，是潜在的神经调控与药物干预靶点。研究人员既往发现脊髓自噬在NP模型中受损，调控自噬具治疗潜力；PrL组织的蛋白质组测序显示自噬发生改变，基因本体（gene ontology, GO）分析提示内质网（endoplasmic reticulum, ER）活性与之关联。内质网自噬（ER-phagy，选择性自噬的一种，指受损ER被自噬体识别并运送至溶酶体降解的过程）可清除错误折叠蛋白、维持分泌稳态并保护神经元免受蛋白毒性应激。刺激因子干扰素基因（stimulator of interferon genes, STING）是位于ER膜上的跨膜蛋白，可作为LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）脂修饰的膜源，ER-phagy可通过cGAS（cyclic GMP-AMP synthase）/STING通路促使STING从ER膜转移至自噬体膜，缓解ER应激。但STING在不同细胞类型及调控程度下对NP疼痛与情绪可能产生矛盾效应，且STING是否通过调控PrL神经元ER-phagy影响SNL（spinal nerve ligation，脊神经结扎）模型小鼠疼痛与情绪行为尚无报道。本研究旨在明确PrL神经元STING–cGAS/STING通路–ER-phagy轴在SNL诱导的NP及情绪共病中的作用机制。

二、主要关键技术方法概述

研究人员采用雄性C57BL/6J小鼠建立SNL神经病理性疼痛模型（假手术对照组仅暴露不结扎切断L₅脊神经），通过立体定位仪向PrL（前囟前AP +1.94 mm，中线旁ML ?0.5 mm，背腹DV ?2.5 mm）微量注射ER应激调节剂（4-PBA、TM）与自噬调节剂（RAP、3-MA），以及携带hSyn启动子的AAV2/9病毒（过表达/敲低FAM134B/RETREG1、过表达/敲低STING、过表达STING?_atg8缺失LC3互作区），皮下给予cGAS/STING抑制剂RU521或激动剂2′3-cGAMP，腹腔给予氯胺酮（ketamine）。术后检测机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold, MWT）与热缩足潜伏期（thermal withdrawal latency, TWL）评价痛觉过敏，强迫游泳实验（forced swim test, FST）评价抑郁样行为，开场实验（open field test, OFT）评价焦虑样行为与自主活动。取PrL组织行Western blot检测ER应激（Grp78、PERK、p-PERK、ATF4、ATF6、IRE1、p-IRE1、cleaved caspase-3）、自噬（LC3-II/I、p62、FAM134B/RETREG1）及cGAS/STING通路（cGAS、STING、p-STING）蛋白，免疫荧光双标鉴定FAM134B与神经元/小胶质细胞标记物共定位，免疫沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）检测STING–LC3及FAM134B–LC3结合，透射电镜观察自噬体包裹ER结构，在体局部场电位（local field potentials, LFPs）记录PrL神经元电活动。统计学采用Shapiro–Wilk正态性检验后行单因素/双因素ANOVA或Kruskal–Wallis非参数检验。

三、研究结果

3.1 SNL Induced ER-Phagy Impairment and Excessive ER Stress in the PrL of Mice

蛋白质组学提示SNL小鼠PrL中ER活性与自噬相关变化；透射电镜可见自噬体包裹ER结构（典型ER-phagy），免疫荧光显示FAM134B主要与NeuN（神经元标记）共定位，少量与Iba-1（小胶质细胞标记）共定位。SNL组出现机械与热痛觉过敏及抑郁样行为，PrL中ER应激标记Grp78上调，UPR（unfolded protein response，未折叠蛋白反应）通路PERK/ATF4、ATF6、IRE1/p-JNK激活，自噬标志LC3-II升高但p62（自噬流负向指标）亦升高提示自噬流受阻，FAM134B升高反映代偿性ER-phagy激活但仍不足以清除过度ER应激，cGAS与p-STING显著升高；Co-IP证实SNL模型中STING及FAM134B均与LC3发生结合。结论：SNL致PrL神经元ER-phagy受损伴过度ER应激及cGAS/STING通路激活。

3.2 Endoplasmic Reticulum Stress and Autophagy Impairment Are Mutually Causal in the PrL of SNL Mice

PrL给予ER应激抑制剂4-PBA可降低Grp78及UPR各分支活化，下调p62、上调LC3-II与FAM134B，减轻cleaved caspase-3，改善MWT、TWL及FST；反之ER应激诱导剂TM加剧ER应激、抑制FAM134B表达（ER-phagy受损）、升高p62与cleaved caspase-3，加重痛觉过敏与抑郁样行为。自噬诱导剂RAP降低UPR活化、升高FAM134B、降p62、改善行为；自噬抑制剂3-MA则相反。结论：PrL内ER应激与自噬/ER-phagy互为因果——抑制ER应激促进ER-phagy，增强自噬缓解ER应激。

3.3 Regulating ER-Phagy in PrL Neurons of SNL Mice Altered Pain-Related and Emotion-Related Behavioral Tests

AAV过表达FAM134B（Retreg1）使SNL小鼠MWT与TWL改善（镇痛），OFT中央区活动时间比与穿越次数增加（抗焦虑），FST不动时间缩短（抗抑郁），WB示FAM134B↑、p62↓；AAV敲低FAM134B则恶化上述所有行为并降低FAM134B、升高p62。结论：PrL神经元ER-phagy水平（经FAM134B/RETREG1介导）正向调控SNL诱发的疼痛与情绪共病——增强ER-phagy具镇痛及改善负性情绪效应。

3.4 STING In the PrL Neurons Participated in SNL-Induced Pain and Emotion-Related Behavior

PrL过表达STING加重SNL小鼠机械/热痛觉过敏、焦虑与抑郁样行为，WB示p-STING↑、FAM134B↓、p62↑；PrL敲低STING则改善上述行为，FAM134B↑、p62↓。注射缺失ATG8（LC3）互作结构域的STING?_atg8破坏STING–LC3结合后，行为恶化程度较STING过表达更显著，FAM134B↓、p62↑、ER应激加重。结论：PrL神经元STING通过与LC3互介调控ER-phagy水平进而影响NP与情绪共病；阻断STING–LC3互作损害ER-phagy并加剧表型。

3.5 cGAS/STING Pathway Regulated ER-Phagy to Modulate SNL-Induced Pain- and Emotion-Related Behaviors

PrL给予cGAS/STING抑制剂RU521降低cGAS及p-STING，升高FAM134B、降p62与Grp78，改善MWT、TWL及FST。腹腔氯胺酮改善MWT/TWL/FST，升高FAM134B与LC3-II、降Grp78/p62/p-STING；联用cGAS/STING激动剂2′3-cGAMP取消氯胺酮的上述获益，FAM134B↓、p62↑、Grp78与p-STING↑。结论：cGAS/STING通路活性负向调控PrL神经元ER-phagy；抑制该通路增强ER-phagy、减轻NP与情绪共病，持续激活该通路削弱ER-phagy并拮抗氯胺酮的治疗效应。

四、讨论与结论翻译

讨论要点：本研究证实SNL小鼠PrL中ER-phagy减轻过度ER应激并产生神经保护作用；FAM134B主要在PrL神经元表达，其介导的ER-phagy是调控NP及情绪共病的关键；STING通过与LC3互作参与PrL神经元ER-phagy调控——下调PrL神经元STING可缓解疼痛与负性情绪共病，而阻断STING–LC3互作损害ER-phagy加重表型；cGAS/STING通路抑制可增强ER-phagy并发挥镇痛抗抑郁作用，该通路过度激活抵消氯胺酮疗效；需注意STING在不同细胞类型（如脊髓小胶质细胞激活STING可镇痛）及不同脑区作用可能存在异质性，性别差异及特定神经环路有待后续研究。

结论（原文翻译）：在SNL小鼠中，增强前边缘皮层（PrL）神经元的内质网自噬（ER-phagy）可通过调控刺激因子干扰素基因（STING）产生镇痛、抗焦虑及抗抑郁效应。