《Journal of Physiology》：Intrinsic pH chemosensitivity of acutely dissociated medullary serotonergic and retrotrapezoid neurones
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摘要：中枢呼吸化学感受器(central respiratory chemoreceptors, CRCs)对于维持正常的全身pH和PCO2水平至关重要，其具体细胞身份长期存在争议。学界普遍认为CRC须通过细胞自主(固有/intrinsic)机制响应微小pH变
摘要：中枢呼吸化学感受器(central respiratory chemoreceptors, CRCs)对于维持正常的全身pH和PCO2水平至关重要，其具体细胞身份长期存在争议。学界普遍认为CRC须通过细胞自主(固有/intrinsic)机制响应微小pH变化，但此前多数鉴定CRC的研究仅阻断了有限的突触机制。研究人员采用膜片钳记录比较两类CRC候选细胞：(1)表达Phox2b的逆行斜方体核(retrotrapezoid nucleus, RTN)神经元；(2)延髓中缝核产生5-羟色胺(serotonin, 5-HT)的神经元，并使用急性分离(acute dissociation)以确保反应为固有性质。当CO2由5%升至9%(pH 7.4→≈7.2)时，48%的延髓5-HT神经元(n=118)放电频率升高>20%，平均增幅139%；而16%的RTN神经元(n=93)放电频率升高>20%，平均增幅46%。表达神经介素B(Neuromedin B, Nmb；提议作为RTN CRCs生物标志物)的RTN神经元并未更可能出现较大pH反应。RTN与5-HT神经元共培养3天后，许多RTN神经元开始接受来自5-HT神经元的兴奋性突触驱动，并对酸中毒产生反应。结果表明延髓5-HT神经元亚群符合CRC特征；多数RTN神经元可能主要负责整合与传递来自5-HT神经元及其他化学感受位点的pH信息，对直接感知pH贡献较小。
论文解读：延髓5-HT与RTN神经元固有pH化学感受性的比较研究
本研究发表于The Journal of Physiology。中枢呼吸化学感受器(central respiratory chemoreceptors, CRCs)是脑干内可检测生理范围PCO2/pH扰动并启动通气、觉醒等反应以恢复酸碱稳态的特化神经元/胶质细胞，其确切细胞身份长期存争议。目前最受关注的两类CRC候选细胞为：(1)表达Phox2b的逆行斜方体核(retrotrapezoid nucleus, RTN／rostral ventrolateral medulla内)神经元；(2)延髓中缝核产生5-羟色胺(serotonin, 5-HT)的神经元。判定CRC的必要条件是细胞具备细胞自主(即固有/intrinsic)的CO2/pH响应能力，但既往脑片或体内研究多仅部分阻断谷氨酸、GABA等受体或使用TTX/低钙液，无法排除递质转运体逆向释放、单胺及肽类递质介导的突触输入影响，不能确证响应为固有性质。为彻底排除外在突触影响，研究人员采用急性酶解分离法获得物理性孤立的RTN(Phox2b+/ChAT?)与延髓5-HT(Pet1-EYFP+)神经元，在完全无突触阻断剂条件下进行全细胞穿孔膜片钳记录，对比两者对生理范围高碳酸性酸中毒(CO25%→9%, pH 7.4→≈7.2)及非生理等碳酸性pH 8.0→7.0的放电频率响应，并通过RNAscope原位杂交检测RTN神经元神经介素B(Neuromedin B, Nmb)表达与化学感受性关联，另将RTN与表达ChR2(channelrhodopsin-2)的5-HT神经元共培养，光遗传激活5-HT终末并应用5-HT7受体拮抗剂SB269970验证突触驱动机制。动物来源为Postnatal(P)6–P10 Phox2b-Cre; tdTomato; ChAT-GFP小鼠取RTN，P11–P16 ePet-EYFP小鼠取延髓5-HT区，部分共培养实验用Tph2-ChR2-EYFP小鼠。
主要关键方法概述：
研究人员取P6–P10 Phox2b-tdTomato/ChAT-GFP三重转基因小鼠延髓斜面或水平切取面神经核腹外侧RTN组织，及P11–P16 ePet-EYFP小鼠延髓腹侧中缝(raphe pallidus/magnus/obscurus)组织，经木瓜蛋白酶或胰酶消化、轻柔吹打获得急性分离单细胞，接种于多聚鸟氨酸包被玻底皿，贴壁1–2天内完成记录以排除突触重建。采用穿孔膜片钳(amphotericin perforated-patch)电流钳模式，灌流aCSF(95% O2/5% CO2, pH 7.4)与高碳酸酸化aCSF(91% O2/9% CO2, pH≈7.2)切换刺激，部分实验用HEPES缓冲等碳酸液(pH 8.0?7.0)。RTN部分细胞记录后做RNAscope检测Nmb mRNA表达。共培养实验中将RTN细胞与Tph2-ChR2-EYFP+5-HT神经元混合培养，长时(17–69天)后全细胞记录RTN神经元对酸中毒响应及473 nm蓝光(5 Hz)光遗传激活5-HT神经元引发的突触反应，并用SB269970(10 μM)阻断测试。
研究结果
Response of acutely dissociated 5-HT and RTN neurones to hypercapnic acidosis（急性分离5-HT与RTN神经元对高碳酸性酸中毒的反应）
CO2由5%升至9%(pH 7.4→≈7.2)时，118个延髓5-HT神经元中48%(57/118)放电频率增加>20%(判定为被刺激)，平均增至对照239%±176%，群体平均放电自1.31±0.80 Hz升至1.81±1.27 Hz(p<0.0001)；93个RTN(Phox2b+/ChAT?)神经元仅16%(15/93)被刺激，平均增至146%±26%，群体平均放电自2.97±1.95 Hz至3.03±2.05 Hz(p=0.380无显著差异)。5-HT神经元响应迅速、可逆、重复性好；RTN中被刺激者响应幅度小、时间锁定性差且重复性弱。两组响应分布差异显著(Mann–Whitney U, p<0.0001)。
A subset of RTN and 5-HT neurones were stimulated by pathological isocapnic changes in pH（RTN与5-HT神经元亚群可被病理性等碳酸pH变化刺激）
pH由8.0降至7.0(无CO2)时，61个5-HT神经元中70%(43/61)增加>50%，平均增至492%±534%；164个RTN神经元中23%(38/164)增加>50%，平均增至213%±60%。差异显著(p<0.0001)。表明即便用大pH阶跃，5-HT神经元固有化学感受性仍强于RTN。
Chemosensitivity is not more common in RTN neurones that express Neuromedin B（表达神经介素B的RTN神经元并不更常见化学感受性）
对39个RTN神经元做RNAscope检测Nmb mRNA(无/低-中度1–2+/高度3+表达)并比对高碳酸酸中毒响应，Kruskal–Wallis检验无关联(p=0.171)；22个细胞比对等碳酸pH响应亦无关联(p=0.462)。斜切与水平切所获RTN神经元化学感受性也无差异(p=0.237)。提示Nmb并非RTN固有CRC标志，表达Nmb的RTN神经元未具更强固有pH敏感性。
Quantification of chemosensitivity by calculating absolute firing rate（以绝对放电频率量化化学感受性）
比较低-中度Nmb+RTN神经元与5-HT神经元中响应最强的前50%或前20%，Nmb+RTN在5%与9% CO2下放电无变化(p=0.801)，而前20% 5-HT神经元自1.19±0.64 Hz升至3.21±1.71 Hz(p<0.0001, +170%)。证实即便选取"最可能是CRC"的Nmb+RTN亚群，仍无固有化学感受性，而5-HT神经元敏感亚群具生理显著固有响应。
RTN neurones developed increased chemosensitivity with time after acute dissociation due to formation of excitatory connections from 5-HT neurones（分离后随时间推移RTN神经元化学感受性增强缘于与5-HT神经元形成兴奋性连接）
急性分离当天RTN几无大响应；培养3–5天(DIV 3–5)后出现强酸中毒兴奋细胞(p=0.0231 vs 1–2 DIV)，而5-HT神经元各时段响应比例无变化(p=0.751)。共培养实验显示：蓝光激活共培养中Tph2-ChR2-EYFP+5-HT神经元可在部分RTN神经元诱发爆发式动作电位，此突触反应被5-HT7受体拮抗剂SB269970(10 μM)阻断(p=0.0003, Friedman's test)并可洗脱恢复。酸中毒响应的RTN神经元更可能对光刺激有反应(p<0.0001, Spearman相关)。表明培养后期RTN出现的"化学感受性"实为接受了化学敏感5-HT神经元经由5-HT7受体介导的兴奋性突触驱动，而非自身固有pH感知。
讨论与结论翻译：
本研究表明48%延髓5-HT神经元对生理范围高碳酸性酸中毒(pH 7.4→≈7.2)具细胞自主兴奋响应，许多反应幅度大、迅速且可逆，符合CRC核心标准；相比之下仅少数RTN神经元具微弱且不稳健的固有响应，且表达Nmb(曾被认为标记RTN CRCs)并不能预测固有化学感受性。共培养揭示RTN神经元在体内/切片中的高CO2响应很大程度上继发于化学敏感5-HT神经元(部分经由5-HT7受体)及他处传入的突触驱动。RTN神经元可能在呼吸节律生成及整合、中继多源化学感受信息至呼吸网络中起重要作用，而非直接作为生理性微小pH变化的初级传感器。延髓5-HT神经元(尤Egr2谱系亚群)是主要的中枢呼吸化学感受器之一。
